蘇凱 雷杰 張偉 張志培 李小飛 周勇安 張平 王小平

細胞與基質(zhì)之間的相互作用對于細胞的某些表型具有重要意義，如果失去基質(zhì)的支持，如某些不具備轉(zhuǎn)移特性的實體瘤細胞和正常上皮細胞從原位脫落進入血流，或在體外培養(yǎng)的情況下人為阻斷細胞的粘附，細胞將發(fā)生程序性死亡，這種現(xiàn)象被稱為“anoikis”[1]，即脫落凋亡或失巢凋亡。腫瘤細胞一旦開始發(fā)生轉(zhuǎn)移，即獲得了抗脫落凋亡的能力。這種存在于某些腫瘤細胞的抗脫落凋亡，是轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生的重要原因之一[2]。目前，關(guān)于脫落凋亡/抗脫落凋亡的研究仍局限在個別基因、個別通路、抗脫落凋亡機理的認識仍不系統(tǒng)，細胞的多樣性以及腫瘤細胞的易突變也賦予不同的腫瘤細胞不同的抗脫落凋亡機制。我們應用高侵襲性肺腺癌A549細胞系，分別在貼壁與懸浮兩種狀態(tài)下培養(yǎng)，檢測兩種不同生長狀態(tài)肺癌A549細胞系基因表達上的差異，旨在高通量地篩選肺癌抗脫落凋亡相關(guān)基因，并從中篩選與肺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，為進一步研究肺癌轉(zhuǎn)移侵襲性提供數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司。胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物制品公司。多聚羥乙基甲基丙烯酸樹脂（Poly-HEMA）購自Sigma公司。DNA提取試劑盒為TIANamp血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒。細胞系：高侵襲性肺腺癌A549細胞系由第四軍醫(yī)大學基礎(chǔ)部生化教研室王江博士惠贈。細胞培養(yǎng)于含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置37oC、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞懸浮培養(yǎng)皿的準備及細胞懸浮培養(yǎng)[3,5]Poly-HEMA溶于無水乙醇（10 g/L）。每個55 mm直徑的petri培養(yǎng)皿加2 mL Poly-HEMA溶液，室溫下待乙醇完全揮發(fā)后，再加1遍Poly-HEMA溶液。臨用前，petri培養(yǎng)皿以PBS洗4遍，置于超凈臺中紫外線照射消毒待用。以胰酶消化貼壁的肺癌細胞，收集細胞，計數(shù)并接種于poly-HEMA處理過的petri培養(yǎng)皿中。每個培養(yǎng)皿加入1×106個細胞，置37oC、5%CO2孵箱中培養(yǎng)72 h，每天觀察細胞狀態(tài)并計數(shù)。由于Poly-HEMA不帶電荷，細胞無法貼壁，只能在培養(yǎng)皿中脫落生長，借此來模擬細胞的脫落培養(yǎng)狀態(tài)，對照組細胞為貼壁培養(yǎng)的細胞。

1.2.2 細胞質(zhì)梯度DNA測定 收集懸浮及貼壁細胞，各取1×106個。紫外燈下觀察DNA ladder[3,4]。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測 收集懸浮及貼壁細胞，各取1×106個細胞轉(zhuǎn)移至離心管，然后用50 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，每組分別加入PI及AnnexinV2FITC，室溫避光30 min上樣。立即用流式細胞儀分析凋亡率。

1.2.4 芯片制備 以貼壁培養(yǎng)A549細胞為對照組，抗脫落凋亡A549細胞為實驗組，利用北京博奧生物芯片公司的人類V2.0全基因組寡核苷酸微陣列芯片（35K Human Genome Array），檢測兩種細胞的基因表達差異。

1.2.5 數(shù)據(jù)檢索 利用北京博奧生物芯片公司CB-MAS 4.0生物分子功能注釋系統(tǒng)篩選表達差異基因，利用NCBI Pubmed數(shù)據(jù)庫進一步篩選與肺癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因。

2 結(jié)果

2.1 抗脫落凋亡肺癌A549細胞培養(yǎng) 在細胞懸浮培養(yǎng)過程中我們觀察到，A549肺癌細胞脫落培養(yǎng)12 h后，細胞開始聚集，24 h后細胞相互聚集成比較大的細胞團塊，且培養(yǎng)時間越長，聚集成的細胞團塊越大、越致密。但較貼壁正常生長A549細胞相比，懸浮培養(yǎng)細胞生長速度明顯變緩，細胞形態(tài)差異明顯（圖1）。

2.2 抗脫落凋亡肺癌A549細胞檢測 收集懸浮及正常貼壁生長72 h細胞進行細胞質(zhì)梯度DNA分析，結(jié)果顯示兩種狀態(tài)培養(yǎng)的肺腺癌A549細胞電泳圖像均未出現(xiàn)凋亡特異性梯度條帶（圖2），說明細胞未發(fā)生凋亡。流式細胞檢測結(jié)果與細胞質(zhì)梯度DNA 測定結(jié)果一致（圖3），兩種培養(yǎng)狀態(tài)下肺癌細胞培養(yǎng)72 h未檢測到細胞明顯凋亡（細胞凋亡發(fā)生率均小于5%）。

圖 1 細胞形態(tài)學表現(xiàn)（×100）A：懸浮培養(yǎng)細胞； B：貼壁培養(yǎng)細胞。Fig 1 Cell morphology (×100)A: suspension cultured cells; B: adherent cultured cells.

圖 2 DNA電泳Fig 2 DNA electrophoresis

圖 3 各組流式細胞凋亡率Fig 3 The percent of apoptotic cells in different groups by FCM

圖 4 基因芯片散點圖紅色標記和綠色標記的數(shù)據(jù)點分別表示懸浮培養(yǎng)細胞組/貼壁培養(yǎng)細胞組的Ratio值≥2和≤0.5，屬于表達有差異的基因；黑色標記表示懸浮培養(yǎng)細胞組/貼壁培養(yǎng)細胞組的Ratio值在0.5和2之間，表達基本無差異。Fig 4 ScaTTered plot graph of Cy3-labeled and Cy5-labeled probes hybirdizing with microarrayRed and green markers represent data points marked the suspension cultured cells group/adherent cultured cells group of the Ratio value of ≥2 and ≤0.5, are there differences in gene expression; Black marker that the suspension cultured cells group/adherent cultured cells group of the Ratio value of 0.5 and the 2 between the expression of the basic no difference.

2.3 人基因表達譜芯片檢測到的表達差異基因 基因芯片檢測（圖4）共得到表達差異的基因745個（Ratio≥2.0或Ratio≤0.5），其中實驗組相對對照組上調(diào)2倍以上的基因數(shù)目有556個，實驗組相對對照組下調(diào)0.5倍以上的基因數(shù)目有189個。所獲得的基因通過NCBI Pubmed檢索其功能。這些表達差異基因涉及原癌基因、抑癌基因、細胞周期蛋白、凋亡、免疫相關(guān)、信號轉(zhuǎn)導、蛋白翻譯合成及一些功能未知的基因。進一步篩選出63個與癌癥轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，其中上調(diào)基因42個，下調(diào)基因21個，在上調(diào)及下調(diào)基因中，部分基因經(jīng)文獻檢索功能與本實驗上下調(diào)關(guān)系不符，如上調(diào)基因為抑癌基因，下調(diào)基因為癌基因等，遂予以剔除，最終選定與本實驗目的相關(guān)的介導肺癌轉(zhuǎn)移的基因38個，其中上調(diào)基因25個，下調(diào)基因13個，列于下表（表1，表2）。

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是造成各種惡性腫瘤患者死亡的主要原因，且是一個極其復雜、涉及腫瘤與宿主間相互作用的多因素過程，包括瘤細胞從原發(fā)腫瘤脫落，進入細胞外基質(zhì)與脈管內(nèi)，直至在遠端適宜組織中克隆生長，期間受到許多相關(guān)基因的調(diào)控。有學者通過對肺癌、腸癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤、口腔鱗狀細胞癌等惡性腫瘤細胞株體外懸浮培養(yǎng)，并通過DNA ladder和流式細胞儀進行與相應正常組織細胞相比，檢測均發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細胞的抗失巢凋亡能力明顯增強；同時，具有高轉(zhuǎn)移能力的細胞株的抗脫落凋亡能力明顯強于低轉(zhuǎn)移細胞株；另外，在裸鼠體內(nèi)進行的腫瘤細胞侵襲實驗也證實，高抗脫落凋亡細胞株轉(zhuǎn)染的裸鼠全身臟器轉(zhuǎn)移率高于對照組[5-10]。這一系列試驗驗證了抗脫落凋亡是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的始動環(huán)節(jié)，并提示此環(huán)節(jié)是受到相關(guān)基因的嚴密調(diào)控。但是目前抗脫落凋亡的相關(guān)基因及其對腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移作用的影響并不十分清楚。因此較全面地探明腫瘤抗脫落凋亡相關(guān)基因及其對細胞侵襲、轉(zhuǎn)移功能的影響具有重要的科研和臨床價值。

鑒于腫瘤細胞的多樣性及易突變性，不同的腫瘤細胞可能存在著不同的抗失巢凋亡機制，我們選擇高侵襲性肺腺癌A549細胞系作為研究對象，首先嘗試構(gòu)建抗脫落凋亡的A549細胞系。本實驗證明，肺癌A549細胞可以懸浮生長不發(fā)生凋亡，但出現(xiàn)成團塊樣生長。懸浮培養(yǎng)的A549細胞成團塊樣生長，我們猜測可能部分代替了細胞與基質(zhì)間互相作用，使腫瘤細胞可在非生理環(huán)境下存活。然而，細胞懸浮狀態(tài)下生長緩慢，說明團塊樣生長并不能完全代替細胞與基質(zhì)間全部生理功能，僅能維持腫瘤細胞在不利的環(huán)境下生存的最低需要。A549細胞的成功懸浮培養(yǎng)，在體外模擬了高侵襲性腫瘤細胞自原發(fā)部位侵入循環(huán)系統(tǒng)遠處轉(zhuǎn)移過程中的生存狀態(tài)，為體外實驗研究惡性腫瘤轉(zhuǎn)移機制提供了很好的模型。

表 1 上調(diào)基因及其功能簡述Tab 1 The up-regulated genes and brief introdutions of their functions

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個涉及細胞多基因的作用過程，目前的研究大都僅僅涉及個別基因，無法從全局的角度宏觀地認識肺癌的進展?；蛐酒瑒t具有高效、靈敏、高通量地分析細胞內(nèi)基因表達譜的優(yōu)勢。我們的研究篩選了745個表達差異基因，并將基因芯片檢查篩選出的表達差異的基因通過NCBI Pubmed進行功能比對。結(jié)果顯示：這些表達差異基因涉及原癌基因、抑癌基因、細胞周期蛋白、凋亡、免疫相關(guān)、信號轉(zhuǎn)導、蛋白翻譯合成及一些功能未知的基因，表明腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個涉及多種基因、多類信號轉(zhuǎn)導通路通路并涉及多個細胞事件的復雜過程[11,12]。我們從中篩選肺癌侵襲轉(zhuǎn)移始動環(huán)節(jié)密切相關(guān)的63個基因，但某些篩選出的基因已知功能與上調(diào)、下調(diào)比例不符，如部分抑癌基因等預期應表達下調(diào)的基因在試驗中表達為上調(diào)，而部分癌基因表達則為下調(diào)，雖然有某些侵襲性腫瘤確實存在某些基因會因腫瘤類型不同而部分上調(diào)，部分下調(diào)的情況，但我們目前的實驗仍不能排除假陽性，這一部分數(shù)據(jù)我們正在進一步研究。而最終篩選出的38個與肺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，為今后系統(tǒng)的研究肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制打下了堅實基礎(chǔ)。