王 兵，姜德友△，劉春紅，柳成剛，郭加利，郭偉光，陳 強(qiáng)，江正龍，張海麗，王書惠

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；

2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

糖尿病心肌損傷系糖尿病（DM）常見慢性并發(fā)癥之一，其病變可以是原發(fā)的，也可繼發(fā)于冠狀動(dòng)脈供血障礙，且心肌病變出現(xiàn)較早，主要表現(xiàn)為心肌舒張和收縮功能障礙，易發(fā)生充血性心力衰竭。其確切的病理機(jī)制尚未徹底闡明，臨床尚無特效藥物，而中醫(yī)藥在防治該病方面很有潛力，但因其病理機(jī)制復(fù)雜，其狀態(tài)的描述和中藥復(fù)方多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制，又是傳統(tǒng)單因素研究理論與方法難以解決的。為此，借助分子生物學(xué)研究方法，采用基因芯片技術(shù)，利用目前國際學(xué)術(shù)界公認(rèn)的Affymetrix公司生產(chǎn)的Rat 2302.0基因芯片，尋找糖尿病心肌病相關(guān)基因，探討糖尿病心肌病分子生物學(xué)機(jī)制，闡釋中藥復(fù)方糖心康治療糖尿病心肌病的作用機(jī)理，對STZ誘導(dǎo)DM大鼠的心臟基因表達(dá)譜進(jìn)行了研究，并對篩選出的差異表達(dá)基因用 Eve green實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)檢測其在大鼠心臟組織中的含量及表達(dá)水平。本文僅報(bào)告糖心康對糖尿病心肌病大鼠心肌組織基因annexin A4 mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥品

鏈脲佐菌素（STZ，CALBIOCHEM，USA）；糖心康為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室制作；Rat 2302.0基因芯片（AFFYMETRIX，USA）。

1.2 動(dòng)物造模及分組

Wistar雄性大鼠，體重200g～230g，除空白對照組外，余者以 25 mg·kg－1STZ左下腹腔注射，每天上午注射1次，連續(xù)5d。造模前12h禁食不禁水，造模1h后大鼠自由飲水、進(jìn)食，造模1周后測血糖，血糖值在16.7mmol/L以上者皆認(rèn)為造模成功。再隨機(jī)分為模型組、治療組，2組均喂以高熱量飼料（高熱量飼料由1％膽固醇、10％豬油、10％蛋黃粉、1％蔗糖、78％基礎(chǔ)飼料制成）13周，共喂養(yǎng)26周。

1.3 給藥方法

治療組以中藥糖心康灌胃，空白組及模型組以生理鹽水灌胃。

1.4 標(biāo)本采集

快速用180℃12 h處理過的手術(shù)剪刀摘取心臟，立即用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，沖洗后在冰上操作，沿心室長軸切取心肌置于液氮中凍存，以備提取RNA使用。

2 心肌組織差異表達(dá)基因的篩選

2.1 總RNA提取

從各組大鼠中取心臟，使用 QIAGEN's RNA easy Total RNA Isolation Kit抽提總 RNA，由純化的總RNA合成雙鏈 cDNA，經(jīng) PLG提取、乙醇沉淀將雙鏈 cDNA純化，用 BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit方法以生物素標(biāo)記cRNA合成，QIAGEN Rneasy Columns法體外轉(zhuǎn)錄純化生物素標(biāo)記的cRNA，用分光光度計(jì)分析RNA濃度進(jìn)行質(zhì)控，凝膠電泳檢測 IVT產(chǎn)物，片斷化 cRNA，合成cRNA探針。

2.2 基因芯片的雜交、洗脫、染色及檢測

合成好的cRNA探針經(jīng)片段化處理后用于與基因芯片雜交?；蛐酒瑸锳ffymetrix Rat 2302.0基因表達(dá)譜芯片，芯片的雜交、洗脫、染色及檢測利用Affymetrix公司生產(chǎn)的專用設(shè)備“基因芯片檢測工作站”（work station）進(jìn)行，操作過程均按該公司推薦的條件進(jìn)行。

2.3 基因芯片檢測數(shù)據(jù)的處理

芯片掃描數(shù)據(jù)應(yīng)用“Affymetrix Microarray Suite software 5.0”進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2.4 結(jié)果

篩選標(biāo)準(zhǔn)說明：差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為change為I或 MI，ratio＞或 =1，實(shí)驗(yàn)組 Detection為 P的為上調(diào)基因，change為D或 MD，ratio＜或 =－1，對照組Detection為P的為下調(diào)基因。

散點(diǎn)圖X軸為對照組信號值，Y軸為實(shí)驗(yàn)組信號值，圖中紅色點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)組和對照組該基因的Detection均為 P，藍(lán)色為2組中有1個(gè)值不是 P，而黃色點(diǎn)為2組均為A（圖1）。

圖1 a.模型組/空白組灰度掃描圖；b.模型組/空白組散點(diǎn)圖c.治療組/模型組灰度掃描圖；d.治療組/模型組散點(diǎn)圖

按照比較嚴(yán)格的條件篩選出差異表達(dá)基因，表達(dá)差異2倍以上的基因列表，包括基因名稱、GenBank號、Uni號和染色體定位。其中，BM385237：annexin A4（anxa4），即膜聯(lián)蛋白 A4，在糖尿病大鼠心肌組織表達(dá)下調(diào)，糖心康治療組表達(dá)上調(diào)。

3 結(jié)果

3.1 空腹血糖、糖化血紅蛋白水平變化

表1顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠空腹血糖（FBG）及糖化血紅蛋白（HbA1C）水平明顯升高，與正常組相比較，差異顯著（P＜0.01），說明鏈脲佐菌素造模成功。治療組較模型組有較大幅度降低，2組比較差異顯著（P＜0.01），但較正常組仍高，說明糖心康有良好的降糖、減輕蛋白非酶糖基化的作用。

表1 各組空腹FBG、HbA1c水平比較±s）

表1 各組空腹FBG、HbA1c水平比較±s）

注：與正常組比較：*P＜0.01；與模型組比較：ΔP＜0.01

組 別 n FBG（mmol/L） HbA1c（％）正常組10 5.19±0.49 3.75±0.51模型組 10 20.53±3.55* 8.62±1.77*治療組 10 10.74±2.54Δ 6.86±1.10Δ

3.2 心肌組織病理及超微結(jié)構(gòu)變化

3.2.1 光鏡下觀察 圖2～4顯示，正常組：心肌纖維走行正常，無肥大，心肌細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，居細(xì)胞中央，心肌間質(zhì)及微血竹等結(jié)構(gòu)正常。模型組：心肌纖維肥大，心肌纖維有大量灶性 PAS陽性物質(zhì)沉積，心肌纖維出現(xiàn)散在或多處大小不等的局灶性、片狀壞死；心肌毛細(xì)血管管腔狹窄、管壁增厚，有大量糖蛋白沉著、管壁內(nèi)皮增生伴乳頭狀凸起，8周、15周、22周呈進(jìn)行性加重。治療組：心肌纖維肥大較輕，心肌內(nèi)有少量PAS陽性物質(zhì)沉積，心肌走行基本正常。

圖2 正常組心肌HE染色（400×）

圖3 模型組心肌HE染色（400×）

圖4 治療組心肌HE染色（400×）

3.2.2 電鏡下觀察 圖5～7顯示，正常組：心肌肌原纖維結(jié)構(gòu)清晰，肌絲排列整齊，各帶明顯，細(xì)胞核發(fā)育良好，線粒體結(jié)構(gòu)完好。呈圓形或橢圓形、嵴規(guī)則、無腫脹、變性等，線粒體及肌絲間糖原顆粒豐富正常，相鄰心肌纖維處可見閏盤連接，心肌纖維間可見許多微血管，毛細(xì)血管基底膜無增厚。模型組：心肌肌原纖維走行紊亂，肌節(jié)破壞斷裂，長短不一，肌絲灶性溶解、消失，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張，可見細(xì)胞核異形變。核周邊有切跡，或固縮、染色質(zhì)邊集，亦可見核內(nèi)空泡樣變，核膜模糊斷裂，核周細(xì)胞器呈點(diǎn)狀、碎片狀等變化，肌漿網(wǎng)囊狀擴(kuò)張，多數(shù)線粒體腫大，嵴斷裂溶解，呈絮狀、水鞘圖樣及空泡樣變，線粒體膜下和基質(zhì)內(nèi)及核膜下電子密度增大（鈣鹽沉積），肌細(xì)胞線粒體間糖原散在，閏盤排列有斷裂現(xiàn)象，壞死的心肌細(xì)胞附近可見成束的膠原結(jié)締組織，成纖維細(xì)胞增生活躍。心肌細(xì)胞間可見少量吞噬細(xì)胞，毛細(xì)血管腔變窄甚至閉塞，內(nèi)皮細(xì)胞肌膜斷裂，核染色體邊集，基底膜增厚。8周時(shí)心肌超微結(jié)構(gòu)即出現(xiàn)異常改變，15周時(shí)加重，22周時(shí)病變更為嚴(yán)重。治療組：心肌肌原纖維大都排列整齊，肌節(jié)發(fā)育良好，明暗帶分明，未見肌絲溶解，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張減輕，細(xì)胞核發(fā)育良好，未見異形樣變，核周有大量豐富的發(fā)育良好的線粒體，仍可見少量灶性絮狀樣變，未見鈣鹽沉積，肌絲及線粒體間糖元顆粒較豐富，閏盤排列緊密，肌細(xì)胞間可見增多的毛細(xì)血管。

3.3 熒光定量RT-PCR對心肌組織annexin A4 mRNA表達(dá)的檢測

采用 Eve green 法，sense primer：5′-CAA ACA CAC GTG GTC TGC CTA-3′，length：21 bp，Tm 值：58℃；anti-sense primer：5′-TTG TAC CCT GCC ACC ATT TTC-3′，length：21 bp，Tm 值：58℃；product length：101 bp，product Tm 值：78℃ 。

3.3.1 RNA樣品反轉(zhuǎn)錄 使用TAKARA公司的RNA PCR kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒提供的反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄體系10 μL，30℃反應(yīng)10 min，42℃反應(yīng)30min～50min，95℃加熱5 min，4℃反應(yīng)5 min中止。

3.3.2 心肌組織 annexin A4 mRNA表達(dá)水平的檢測結(jié)果 表2顯示，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中，為了定量和比較的方便，引入熒光閾值（threshold）和 CT（threshold value）值的概念。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的1個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，CT值與起始模板的關(guān)系為每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。模型組大鼠心肌組織中 annexin A4 mRNACT值上調(diào)，說明annexin A4 mRNA在心肌組織表達(dá)量減少，與空白組比較差異顯著（P＜0.05）。而經(jīng)糖心康治療后大鼠心肌組織中annexin A4 mRNACT值下調(diào)，說明糖心康能增加 annexin A4 mRNA在心肌組織的表達(dá)量，與模型組比較有顯著差異（P＜0.05）。

表2 各組annexin A4 mRNA的表達(dá)水平比較

4 討論

本研究以《金匱》治療消渴病理法及相關(guān)論述為指導(dǎo)，并結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)該病氣陰兩虛血瘀網(wǎng)絡(luò)式錯(cuò)綜復(fù)雜的病變性質(zhì)，主張隨病證宜多法聯(lián)用，從而確定了益氣養(yǎng)陰活血為該病的主要治法，研制出中藥復(fù)方糖心康，由太子參、黃芪、麥冬、玉竹、枸杞、丹參、土鱉蟲等藥組成。方中太子參與黃芪配伍，以增強(qiáng)益氣之效，合枸杞、麥冬、玉竹共收益氣養(yǎng)陰之功。丹參伍用土鱉蟲增強(qiáng)活血化瘀之力。諸藥相合，補(bǔ)而不滯膩，通而不傷正，滋而不助濕，溫而不傷陰，共奏益氣養(yǎng)陰、通絡(luò)化瘀之效。

BM385237：annexin A4，膜聯(lián)蛋白 A4（anxa4）。膜聯(lián)蛋白家族（annexins）是一類與Ca2+結(jié)合后可進(jìn)一步與膜磷脂結(jié)合的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，迄今為止，從真菌、原生生物到植物、高等脊椎動(dòng)物等超過65種不同種屬范圍內(nèi)，已發(fā)現(xiàn)160種以上的annexins成員。在哺乳動(dòng)物中有 12種，命名為ANXA 1-A 11、A 13，它們廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)膜下、儲(chǔ)Ca2+細(xì)胞器附近以及在核內(nèi)或細(xì)胞外基質(zhì)中。從免疫交叉反應(yīng)及其蛋白質(zhì)和cDNA序列分析結(jié)果證明，它們在結(jié)構(gòu)上具有相似性，功能上也有許多相同點(diǎn)。Annexins家族都具有高度保守的C端中心結(jié)構(gòu)域和獨(dú)特的N末端。中心是由4～8個(gè)同源重復(fù)序列形成的一個(gè)略有彎曲、具有凹凸兩面的盤狀結(jié)構(gòu)，每個(gè)重復(fù)序列由約70個(gè)氨基酸形成的5個(gè)a-螺旋連接成緊密的結(jié)構(gòu)域。C端有蛋白水解位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)以及與其他蛋白質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)，是annexins的調(diào)節(jié)區(qū)域。Annexins各成員N端的序列長度各不相同，僅在蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)上序列相近。有實(shí)驗(yàn)證明，N端輕微改變不影響總體盤狀結(jié)構(gòu)，但在功能上影響凸面Ca2+依賴的磷脂結(jié)合功能，從而改變其分子生物學(xué)特征。目前針對annexins的生物學(xué)功能還只是一些初步研究，它們在細(xì)胞中發(fā)揮諸如抑制磷脂酶A2活性、參與細(xì)胞骨架活動(dòng)、參與磷脂化與膜受體的功能調(diào)節(jié)、抗凝、傳導(dǎo)有絲分裂信息以及促進(jìn)細(xì)胞分泌等重要生物功能。對annexins早期研究主要集中在其參與炎癥機(jī)理的反應(yīng)方面。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用，如介導(dǎo)凋 亡、分 化 等。 且 以 annexinA1、annexinA2、annexin A5的相關(guān)報(bào)道較多，而中藥復(fù)方對糖尿病狀態(tài)下annexin A4調(diào)控研究未見專門報(bào)道。

膜聯(lián)蛋白A4（anxa4）屬于膜聯(lián)蛋白家族，其基因定位于2p13，該蛋白廣泛存在于動(dòng)植物的各組織器官，約占細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)總量的2％。其是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，具有磷脂酶抑制因子、與鈣離子結(jié)合、與鈣依賴磷脂結(jié)合的活性，可促進(jìn)膜融合，參與囊胞運(yùn)輸、鈣離子通道形成、細(xì)胞骨架活動(dòng)、磷脂化與膜受體的功能調(diào)節(jié)以及胞吞、胞吐和分泌等重要生物學(xué)功能。新近文獻(xiàn)報(bào)道，annexins A4可能具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能，而這些生物學(xué)行為失調(diào)可能與糖尿病心肌損傷的發(fā)生具有較強(qiáng)的相關(guān)性。有研究證明，annexins A4可以抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的穩(wěn)定，從而避免心肌收縮功能異常，同時(shí)還可能增強(qiáng)細(xì)胞對凋亡的抵抗能力。

本實(shí)驗(yàn)基因芯片結(jié)果顯示，annexins A4在糖尿病狀態(tài)心肌組織表達(dá)下調(diào)，提示糖尿病心肌病的發(fā)生可能與annexins A4的基因調(diào)控有關(guān)，其機(jī)制可能在于：（1）鈣調(diào)控失衡引起心肌收縮功能異常，導(dǎo)致或加重糖尿病性心肌病大鼠心肌損傷；（2）不利于心肌細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的形成；（3）心肌細(xì)胞生長、分化或凋亡異常導(dǎo)致心肌損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病性心肌病時(shí) annexins A4 mRNA呈低表達(dá)，而應(yīng)用中藥復(fù)方糖心康后，annexins A4 mRNA表達(dá)上調(diào)，說明糖心康可通過上調(diào)糖尿病大鼠心肌組織annexins A4 mRNA的表達(dá)，保護(hù)心肌組織，延緩疾病進(jìn)一步發(fā)展。