薛金愛,趙彥宏,王艷芳,李潤植

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山西 太谷030801;2.魯東大學(xué)生命科學(xué)院,山東 煙臺264025)

隨著生物基因組學(xué)的廣泛構(gòu)建,有關(guān)基因組結(jié)構(gòu)、組成、DNA序列變異與進化、基因組遺傳作圖以及基因組改良的研究已成為當(dāng)今生物學(xué)最活躍的研究領(lǐng)域。制備高質(zhì)量的基因組高分子量(HMW)DNA是進行基因組學(xué)研究,特別是BAC(bacterial artificial chromosome)克隆,YAC(yeast artificial chromosome)克隆DNA文庫構(gòu)建和全基因組物理作圖至關(guān)重要的基礎(chǔ)工作[1～3]。常規(guī)提取基因組DNA的方法需要研磨生物組織,使用含蛋白酶K、去垢劑和EDTA等化學(xué)藥品。用這些方法所提取的DNA分子多為小于500 kb,不能用于高質(zhì)量DNA文庫(如YAC文庫)的構(gòu)建和基因組物理作圖。曾有先輩建立了先用瓊脂糖包埋酵母細胞,然后進行分解提取酵母基因組 HMW DNA的方法。瓊脂糖包埋法可使大分子DNA不被分解液及后續(xù)操作所降解,保持DNA完整?；诃傊前穹?從擬南芥、番茄等生物中分離基因組高分子DNA的方法也已建立。Cheung和Gale[4]報道了基于瓊脂糖包埋法制備小麥、大麥和黒麥基因組HMW DNA方法。該方法用于大麥基因組DNA制備還存在著DNA產(chǎn)量低,時間長等不足。迄今,還沒有一種較好的提取大麥基因組完整的高分子量DNA的方法。

本文在前人研究的基礎(chǔ)上,對瓊脂糖包埋大麥原生質(zhì)體和細胞核這兩種提取DNA的方法進行了比較,改進和優(yōu)化,建立了較理想的適合于從大麥幼苗葉片中提取大麥基因組高分子量DNA的有效方法。限制酶消化,脈沖電場凝膠電泳(PFGE)和Southern雜交等檢測表明,新改進的方法實驗流程縮短,效率提高,所分離HWM DNA能更好地滿足后續(xù)相關(guān)研究的需要。

1 材料與方法

1.1 植物材料與試劑

大麥植物材料:生長14 d和4周的大麥幼苗葉片。

試劑:

原生質(zhì)體緩沖液(10 mmol·L-1CaCl2·2H2O,1μmol· L-1CuSO4· 5H2O,0.2 mmol· L-1KH 2PO4,10 mmol·L-1KI,1 mmol·L-1KNO3,0.7 mol· L-1Mannitol,2 mmol· L-1MES,1 mmol·L-1MgSO4·7 H2O,最后用KOH調(diào)整到pH 8.5)

酶溶液[0.8%纖維素酶Onokzuka R-10(Yakult,Tokyo,Japan),0.4%Macerocyme Onokzuka R-10(Yakult,Tokyo,Japan),0.04%PectoylaseY23(Seishin,Tokyo,Japan)].

分解液(0.5 mol·L-1EDTA pH 8.0,10 m mol·L-1Tris,pH 8.0,1%sarkosyl,2 g·L-1蛋白酶K)

勻化緩沖液(HB)母液:0.1 mol·L-1trizma base,0.8 mol· L-1KCl,0.1 mol· L-1EDTA,10 mmol·L-1spermidine,10 mmol·L-1spenine,最后用NaOH調(diào)整p H 9.4～9.5,在4℃下保存。

HB(1×):1×HB+0.5 mol·L-1sucrose,4℃下保存,使用前再加入β-巰基乙醇使終濃度為0.15%。

漂洗緩沖液(1×HB+0.5%TritonX-200,4℃下保存,用前加入β-巰基乙醇使終濃度為0.15%。

TE緩沖液(10 mol·L-1Tris-HCl p H8.0,1 mmol·L-1EDTA p H 8.0)。

酶解緩沖液(其中含有8 mmol·L-1的亞精胺和2 g·L-1的 BSA)

1.2 瓊脂糖包埋原生質(zhì)體

參照Cheung和Gale[4]方法并做修改。以生長14 d的大麥幼苗葉片為材料,經(jīng)過一系列的操作先提取出原生質(zhì)體,再把葉組織用4 mL原生質(zhì)體緩沖液漂洗4次,以促進原生質(zhì)體進一步解離。然后,將含有原生質(zhì)體的溶液用40μm和20μm的尼龍篩過濾。將收集到的過濾液,少許離心(26 g,10 min)后獲得原生質(zhì)體沉淀。再用原生質(zhì)體緩沖液漂洗原生質(zhì)體沉淀,最終濃度為每毫升4.5×106個原生質(zhì)體。加入等體積的含有2%瓊脂糖和0.17 mol·L-1EDTA的低溶點的瓊脂糖溶液,混勻,45℃下保存?zhèn)溆?。將含有原生質(zhì)體的低溶點瓊脂糖溶液分裝入塑料鑄模中(長×寬×高:10 mm×5 mm×1.5 mm),4℃下,固化 30 min。將固化的含有原生質(zhì)體的瓊脂糖塊于50℃下用分解液(0.5 mol·L-1EDTA pH 8.0,10 m mol·L-1Tris p H 8.0,1%sarkosyl,2 g·L-1蛋白酶 K)處理48 h。再用0.5 mol·L-1EDTA 于50℃下漂洗4次。收集 DNA于 0.5 mol·L-1EDTA中,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 瓊脂糖包埋細胞核

參考邱芳等的方法[5]稍做修改進行。取生長4周的大麥幼苗葉片,將其切碎,加入液態(tài)氮研磨至粉末狀并轉(zhuǎn)移到加有200 mL冰冷的混合液(1×HB,0.15%的β-巰基乙醇,0.5%的 TritonX-100)的燒杯中。在冰上輕輕攪動混合液10 min,混勻后過濾。過濾后的混合液4℃下離心(1800 g)20 min。棄除上清液,收集細胞核沉淀。然后用1 mL未加入β-巰基乙醇的1×HB液重新懸浮細胞核,冰上保存。最后將細胞核包埋到瓊脂糖塊中,按瓊脂糖包埋原生質(zhì)體方法進行解離和漂洗[6]。

1.4 高分子量(HMW)DNA的限制性酶解

先用冰冷的TE(10 mol·L-1Tris-HCl p H 8.0,1 mmol·L-1EDTA p H 8.0)緩沖液漂洗含有HMW 的DNA的瓊脂糖塞(塊),然后將漂洗過的瓊脂糖塞(塊)放入500μL限制性酶解緩沖液中,在4℃下進行預(yù)酶解處理。接著再將瓊脂糖塞轉(zhuǎn)入500μL新配制的與上述相同的緩沖液中,加入PvuI和NotI這兩種限制性酶,在該限制性酶所要求的溫度下,酶解處理4 h至過夜。在每個酶解反應(yīng)樣品中加入0.5 mol·L-1EDTA,以終止酶解反應(yīng),在4℃下保存以備用。此時,經(jīng)過酶解的瓊脂糖塞就可以用來進行電泳分離。

1.5 脈沖電場凝膠電泳(PFGE)[7]分離酶解DNA

片段,轉(zhuǎn)膜,Southern雜交和雜交信號的檢測

用CHEF DRⅡ(Bio-Rad.USA)電泳儀進行PFGE電泳,溫度 14℃,電壓200 V,分離 HMW DNA的脈沖和電泳時間見表1。電泳完畢,EB染色;然后用凝膠成像儀拍照。將凝膠電泳所分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到Hbond-N+雜交膜(Amershan USA)上,轉(zhuǎn)移液為0.4 mol·L-1的NaOH 。然后用32P標(biāo)記的探針進行Southern雜交。在暗室中,將雜交和漂洗后的Hbond-N+雜交膜用X光膠片曝光,放射自顯影;然后在暗室中取出膠片,進行顯影和定影。讀取和記錄雜交信號(雜交斑點或者帶)。

表1 限制性酶解的HMW DNA的電泳參數(shù)Table1 Electrophoretic parameters used to resolve the restricted HMW DNA

2 結(jié)果與討論

比較兩種不同方法所提取的高分子量DNA的PFGE電泳結(jié)果,分析所獲高分子量的DNA片段的數(shù)量和質(zhì)量,從而確定這兩種方法中哪種方法提取的基因組DNA數(shù)量多,質(zhì)量高較適合后續(xù)的研究。這兩種方法是:瓊脂糖包埋原生質(zhì)體和瓊脂糖包埋細胞核。優(yōu)化后的試驗流程如圖1所示:

圖1 試驗流程Fig.1 Experiment process

制備過程中為了確保細胞核完整無損,將細胞核從勻化緩沖液中分離出來,用DAPI染色,在熒光顯微鏡上觀察,計數(shù),以確保樣本中有大量完整無損的細胞核(＞95%)。原生質(zhì)體的分離和完整性可通過倒置顯微鏡來檢測。然后用瓊脂糖包埋完整的細胞核或原生質(zhì)體,以制備高分子量DNA。用脈沖場電泳檢測這兩種方法所分離DNA片段的數(shù)量和質(zhì)量。DNA分子大小標(biāo)記為由釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粟酒酵母(Scizosaccharomyces pombe)染色體所制備的高分子量DNA,分別為220 kb～2.2 Mb(M1)和 2.2 Mb～4.6 Mb(M2)。

如圖2a所示,經(jīng)脈沖場電泳分離后,絕大多數(shù)DNA滯留在點樣孔(D)及其附近凝縮區(qū)中(DZ)。瓊脂糖包埋細胞核方法提取的DNA數(shù)量大,而原生質(zhì)體方法提取的DNA數(shù)量少。細胞核和原生質(zhì)體法所提取的DNA也含有少量低分子量的DNA片段,凝膠中呈現(xiàn)輕微拖尾狀。這兩種方法提取的DNA分子絕大多數(shù) ＞1.6 Mb(圖2a),其中＞4.6 Mb(圖2b)占主要部分。這樣大小的DNA能滿足BAC克隆,YAC克隆文庫構(gòu)建和基因組物理作圖的要求[7]。相比較而言,瓊脂糖包埋細胞核方法制備的大麥基因組DNA質(zhì)量優(yōu)于原生質(zhì)體法所提取的DNA。

為驗證這兩種方法所分離的DNA能否被限制性內(nèi)切酶所消化以及酶解片段大小是否適合物理作圖對大片段的要求,我們用兩種稀有限制性內(nèi)切酶(PvuⅠ,NotⅠ)和三種常見限制性內(nèi)切酶(EcoR1,HindIII,BamH1)對這些HMW DNA進行限制性消化處理,接著用PFGE電泳分離。電泳后,凝膠體用EB染色,在清水中脫色過夜,結(jié)果如圖2b。絕大部分細胞核法和原生質(zhì)體法制備的未切割DNA是大于4.6Mb的HMW DNA(滯留在點樣孔及其附近凝膠中)。也能看見一些低分子量DNA,呈輕微拖尾狀。這兩種酶能完全酶解HMW DNA(點樣孔中DNA已全部消失)。具有6個堿基識別位點的PvuI酶解細胞核法制備的DNA,酶解所得的DNA片段均小于2.2 Mb,而具有8個堿基識別位點的NotI酶所切割的DNA片段接近于2.2 Mb。酶切所得DNA片段大小亦能滿足后續(xù)研究的要求。稀有內(nèi)切酶酶解結(jié)果亦表明瓊脂糖包埋細胞核法制備的大麥HMW DNA的數(shù)量多,質(zhì)量好。

圖2 兩種不同方法制備大麥基因組HMW DNA的比較Fig.2 Comparison of high molecular weight(HMW)DNA prepared from Hordeum vulgare nuclei and protoplasts

三種常見限制性內(nèi)切酶對這兩種方法提取的HMW DNA酶解結(jié)果見圖3a。這些酶解所得到的片段大小多數(shù)介于4 kb和1 Mb之間,為不連續(xù)的帶型,這正是物理作圖所需的。酶解DNA轉(zhuǎn)膜后,與在大麥基因組有多個位點的探針 BCD1380進行雜交。在各酶解DNA樣品中均獲得多拷貝的雜交信號(圖3b)。Southern雜交結(jié)果再次顯示本研究所優(yōu)化的提取大麥HMW DNA方法所獲得高質(zhì)量DNA能適于后續(xù)大片段克隆文庫構(gòu)建和物理組圖。

前期研究應(yīng)用原生質(zhì)體分離的HMW DNA已成功地用作物理作圖[8],然而物種不同,分離原生質(zhì)體所需要的條件和方法也不同[9]。分離細胞核的條件及程序則不存在物種特異性限制。近年來,應(yīng)用瓊脂糖包埋細胞核制備HMW DNA方法在其他植物上也已建立,如raspherry(Rubus idaeus)和blackcurrant(Ribes nigrum)[10],蠶豆(Vicia f abaL.)和香蕉(Musa acuminateColla)[11],柑桔(Citrusclementina)[12]。DNA 方法還存在比如DNA量少、易降解、操作繁瑣等不足[13]。我們對已有的方法[4]進行了改進和優(yōu)化,操作容易,很少發(fā)生細胞核丟失。通過上述的分析和比較,確定由瓊脂糖包埋細胞核制備DNA的方法所獲得HMW DNA產(chǎn)量大,質(zhì)量更好,絕大部分DNA的分子量大于4.6Mb。稀有和常見限制性酶酶解及PFGE電泳分離后,非常適于后續(xù)的大片段克隆文庫和物理作圖等基因組學(xué)研究。本文所優(yōu)化的提取大麥HMW DNA方法亦可借鑒用于其他作物基因組高分子量DNA的分離。

圖3 大麥基因組HMW DNA的限制性酶解和southern雜交分析Fig.3 Restriction enzyme digestion and southern hybridization of Hordeum vulgare HMW DNA

[1]Zhang H B,Zhao X,Paterson A H,et al.Preparation of megabase size DNA from plant nuclei[J].Plant J,1995,7:175-184.

[2]郭東偉,佘茂云,李連城,等.以小麥根尖分生組織細胞核及染色體制備高分子量DNA[J].作物學(xué)報,2006,32(12):1920-1923.

[3]Ahmadikhah A.A rapid mini-prep DNA extraction method in rice[J].African Journal of Biotechnology,2009,8(2):323-327.

[4]Cheung W Y,Gale M D.The isolation of high molecular weight DNA from wheat,barley and rye for analysis by pulse-field gel electrophoresis[J].Plant Molecular Biology,1990,14(5):881-888.

[5]邱芳,伏健民,王斌.從植物細胞核分離大分子量的核DNA[J].植物學(xué)報,1999,41(11):1204-1207.

[6]Woo SS,Rastogi V,Hong bin Zhang,et al.Isolation of megabase-size DNA from sorghum and applications for physical mapping and bacterial and yeast artificial chronosome library constraction[J].Plant M olecular Biology,1995,13(1):82-94.

[7]楊繼良,王慶華,Deng Daiyong.Comparative studies on preparation of Large Plant DNA Fragments by PFGE[J].高技術(shù)通訊(英文版),2004,10(1):34-40.

[8]Wu K S,Tanksley S D.Abundance polymorphism and genetic mapping of microsatellites in rice[J].Molecular&General Genetics:MGG.1993,241(1/2):225-235.

[9]Ganal M W,Young N D,Tanksley S.D.Pulsed field gel electrophoresis and physical mapping of large DNA fragments in the Tm-2a region of chromosome 9 in tomato[J].M G G:Molecular&General Genetics.1989,215(3):395-400.

[10]Hein,Williamson I S,Russell J,et al.Isolation of high molecular weight DNA suitable for BAC library construction from woody perennial soft-fruit species[J].biotechniques.2005,38:69-71.

[11]Simkova H,cihalikova J,vrana M A,et al.Preparation of HMW DNA from plant nucleiand chromosomesisolated from root tips[J].Biologia plant arum.2003,46(3):369-373.

[12]Terol J,Naranjo M A,Ollitrault P,et al.Development of genomic resources for Citrus clementina:Characterization of three deep-coverage BAC libraries and analysis of 46,000 BAC end sequences[J].BMC Genomics 2008,9:423.

[13]Ghalib-Shalaldeh.Influence of Two Genomic DNA Extraction method s on DNA quantity and quality extracted from Barley in Jordon[J].Biotechnology,2006,5(4):508-513.