劉中華,張 杰,郭 婕

褐藻膠寡糖激發(fā)子活性研究

劉中華,張 杰,郭 婕

(周口師范學(xué)院生命科學(xué)系,河南周口466000)

寡糖可作為激發(fā)子誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性反應(yīng),提高防御酶活力,積累植保素,從而增強(qiáng)自身的抵抗力.本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)菌AGN12的胞外酶對(duì)褐藻膠進(jìn)行生物降解,得到不同聚合度的寡糖樣品.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,褐藻膠寡糖能激活大豆子葉的防衛(wèi)系統(tǒng),誘導(dǎo)合成和積累較多的植保素,并且對(duì)大豆子葉防御酶有良好的誘導(dǎo)作用.

褐藻膠寡糖;激發(fā)子活性;大豆子葉;植保素;苯丙氨酸解氨酶

盡管化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了巨大作用,但頻繁而不加區(qū)分地隨意施用已引發(fā)嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境污染和藥物殘留等危害人類(lèi)健康的問(wèn)題[1].某些寡糖具有激發(fā)子活性,在植物抗病生理過(guò)程中能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生植保素和防衛(wèi)響應(yīng)因子,抵御外來(lái)微生物的侵染[2].首先被發(fā)現(xiàn)具有激發(fā)子活性的是來(lái)自于病原菌 Phytophthora sojae細(xì)胞壁碎片中的寡糖,能夠誘導(dǎo)植物合成植保素,抵御植物病原菌的侵染[3].因此,寡糖作為化學(xué)農(nóng)藥的替代品,具有對(duì)人類(lèi)和生態(tài)環(huán)境無(wú)害、不易產(chǎn)生抗藥性、可生物降解等優(yōu)點(diǎn),已成為生物農(nóng)藥的發(fā)展方向.褐藻膠降解菌AGN12能夠分泌褐藻膠裂解酶,通過(guò)β -消去反應(yīng)裂解褐藻膠,并在非還原末端產(chǎn)生C4,5不飽和雙鍵[4],這種帶有不飽和雙鍵的褐藻膠寡糖具有激發(fā)子活性,誘導(dǎo)植物的自我防御響應(yīng)[5-6].本文利用細(xì)菌A GN12分泌的褐藻膠裂解酶對(duì)褐藻膠進(jìn)行生物降解,檢測(cè)了不同降解程度的褐藻膠寡糖的激發(fā)子活性,旨在為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

褐藻膠降解菌AGN12,由腐爛海帶中分離得到.

1.1.2 大豆子葉

市售新鮮大豆經(jīng)水培得到.

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基:海藻酸鈉7 g,(NH4)2SO43 g, NaCl 5 g,三種無(wú)機(jī)鹽溶液(5%K2HPO4,2.5% MgSO4,7%KNO3)各10 mL,瓊脂18 g,去離子水1000 mL,p H 7.0.

種子培養(yǎng)基:海藻酸鈉7 g,(NH4)2SO43 g, NaCl 5 g,三種無(wú)機(jī)鹽溶液(5%K2HPO4,2.5% MgSO4,7%KNO3)各10 mL,去離子水1000 mL, p H 7.0.

發(fā)酵培養(yǎng)基:同種子培養(yǎng)基.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶液制備

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGN12的種子培養(yǎng)液以3%接種量接入液體培養(yǎng)基,30℃搖床培養(yǎng)24 h后,將發(fā)酵液在4℃,10 000 r/min離心10 min,取上清液作為粗酶液.

1.2.2 褐藻膠寡糖的制備

將p H 7.0的0.03 g/mL的褐藻膠溶液于30℃水浴中預(yù)熱10 min后,與粗酶液按體積比5∶1混合,在30℃水浴中催化褐藻膠降解反應(yīng).每隔30 min取樣一次,沸水浴中加熱20 min終止反應(yīng)后,作為褐藻膠寡糖樣品,并分別測(cè)定其粘度、還原糖濃度和總糖濃度.還原糖濃度采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定[7].總糖濃度采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定[7].粘度測(cè)定采用毛細(xì)管自然沉降法測(cè)定,取一支0.1 mL的移液管吸取待測(cè)樣品至滿(mǎn)刻度,記錄溶液下降 0.05 mL所需要的時(shí)間,并以時(shí)間“秒”為粘度計(jì)量單位.

1.2.3 褐藻膠寡糖激發(fā)子活性的測(cè)定

1.2.3.1 植保素測(cè)定

大豆子葉法[8]:取長(zhǎng)勢(shì)相同的大豆子葉,用無(wú)菌蒸餾水沖洗干凈,再用濾紙吸干.在無(wú)菌條件下,用刀片削去子葉下表皮,形成厚約1 mm,長(zhǎng)度約6 mm的傷口,去離子水浸泡清洗約30 s后,取出,用濾紙吸干水分,放置在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中,每個(gè)培養(yǎng)皿中放10片子葉作為一個(gè)處理.分別用0.02 mL褐藻膠寡糖樣品處理每片子葉傷口后,在25℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h,然后將每組子葉轉(zhuǎn)移到盛有10 mL去離子水的三角瓶中振蕩30 s,測(cè)定OD286,以此來(lái)表示大豆植保素的相對(duì)含量.

1.2.3.2 苯丙氨酸解氨酶活性測(cè)定

按大豆子葉法對(duì)大豆子葉作劃傷處理,分別取0.02 mL褐藻膠寡糖樣品處理每片子葉傷口后,在25℃黑暗條件下培養(yǎng),每隔一段時(shí)間取樣一次.將約2 g(10片)的大豆子葉,置于含有0.6 mL甘油,1.2 mL,7 mmol/L L-半胱氨酸和4.2 mL,50 mmol/L Tris-HCl(p H 8.8)緩沖提取液中,冰浴研磨,于4℃下10 000 r/min離心10 min,上清液即是粗酶液.取0.1 mL粗酶液,與0.2 mL 100 mmol/L苯丙氨酸溶液混合,37℃水浴保溫 30 min,用0.1 mol/L的三氯乙酸0.4 mL終止反應(yīng),加3 mL水后,測(cè)定OD290.以0.1 mL提取液代替0.1 mL粗酶液,按上述反應(yīng)條件與苯丙氨酸溶液反應(yīng),所得的溶液作為空白.苯丙氨酸解氨酶的活力單位定義為:上述反應(yīng)條件下,在30 min內(nèi)生成的肉桂酸使OD290增加0.01個(gè)單位所需要的酶量為一個(gè)活力單位.

2 結(jié)果與討論

2.1 褐藻膠寡糖樣品的特征

褐藻膠降解酶催化褐藻膠降解,每隔30 min取樣一次,測(cè)定反應(yīng)液的黏度、還原糖濃度和總糖濃度,并通過(guò)總糖與還原糖的比值計(jì)算褐藻膠水解物的表觀(guān)聚合度,結(jié)果如表1所示.

表1 寡糖樣品的特性

由表1可以看出,在褐藻膠降解過(guò)程中,反應(yīng)液黏度隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低,在最初的幾小時(shí)黏度下降的較快,最后黏度基本保持不變.還原糖濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,但還原糖達(dá)到最大值時(shí)的時(shí)間滯后于粘度降到最低的時(shí)間.平均聚合度隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,最后基本保持不變.

2.2 褐藻膠寡糖激發(fā)子活性

2.2.1 植保素

所制備的寡糖是否具有激發(fā)子活性可以通過(guò)多種生物學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè),其中最傳統(tǒng)的方法是測(cè)定大豆子葉中植保素的積累.并非所有的寡糖都能激發(fā)植物細(xì)胞產(chǎn)生自我防御響應(yīng),寡糖的激發(fā)子活性一般與其聚合度有關(guān)[1],聚合度太小的寡糖不能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng),而聚合度太大的寡糖由于細(xì)胞壁的屏障作用無(wú)法與細(xì)胞膜接觸,因此,只有特定長(zhǎng)度的寡糖才具有激發(fā)子活性.因此本文將表1中不同聚合度的寡糖樣品分別進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖1所示.

由圖1可知,不同的褐藻膠寡糖樣品誘導(dǎo)植保素的生成能力不同,褐藻膠寡糖的激發(fā)子活性與聚合度有關(guān),最初生成的寡糖樣品不具有誘導(dǎo)能力,而樣品S4、S5和S7能夠誘導(dǎo)生成較高濃度的植保素,說(shuō)明它們具有較好的激發(fā)子活性.其中寡糖樣品S7所誘導(dǎo)生成的植保素含量最高,說(shuō)明寡糖樣品S7在大豆子葉中具有最強(qiáng)的激發(fā)子活性,此時(shí)的表觀(guān)聚合度為6.8.

圖1 褐藻膠寡糖誘導(dǎo)植保素的積累

2.2. 苯丙氨酸解氨酶

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是普遍存在于高等植物中的一種酶.植物次生代謝產(chǎn)物類(lèi)黃酮植保素和木質(zhì)素的生物合成都必須通過(guò)苯丙烷類(lèi)代謝途徑, PAL酶是植物苯丙烷類(lèi)代謝途徑中的限速酶,因此PAL酶活性也被作為測(cè)定激發(fā)子活性的重要生理指標(biāo).根據(jù)大豆子葉法測(cè)定結(jié)果,選取激發(fā)子活性最強(qiáng)的寡糖樣品S7作為實(shí)驗(yàn)材料,進(jìn)一步研究褐藻膠寡糖對(duì)大豆子葉防御酶的激活作用.

圖2 褐藻膠寡糖對(duì)PAL酶活性的誘導(dǎo)

由圖2可知,經(jīng)寡糖樣品S7處理后,大豆子葉中PAL酶活性均明顯高于對(duì)照,說(shuō)明褐藻膠寡糖能誘導(dǎo)PAL酶活性,其活性變化趨勢(shì)與對(duì)照組的變化一致,經(jīng)S7處理后的大豆子葉中PAL酶最大活性比處理前高36%,比對(duì)照組高19%.

3 結(jié)論

褐藻膠寡糖具有激發(fā)子活性,能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞合成植保素.表觀(guān)聚合度為6.8的褐藻膠寡糖具有最強(qiáng)的激發(fā)子活性,且該寡糖在誘導(dǎo)大豆子葉防御系統(tǒng)方面可起到與病原菌類(lèi)似的作用,使植物體PAL活力提高,從而提高植株的抗病性.

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Elicitor-activity of oligosaccharide produced from alginate

LIU Zhonghua,ZHANG jie,GUO jie
(Department of Life Science,Zhoukou Normal University,Zhoukou 466000,China)

Oligosacchride could induce the phytoalexin to make plant respond to phytopathogenic attack.It was found that alginate could be degraded to oligosaccharide by strain AGN12.In this paper,oligosaccharide samples with different degree of polymerization were prepared by degrading alginate with strain AGN12.The results indicated that alginate-oligosaccharide could induce the phytoalexin in soybean cotyledon and elimite defense response enzymes.

alginooligosaccharides;elicitor-activity;soybean cotyledon;phytoalexin;PAL

Q81

A

1671-9476(2010)05-0082-03

2010-02-17;

2010-05-11

周口師范學(xué)院青年科研基金資助項(xiàng)目(No.ZKNUQN200916)

劉中華(1982-),女,河南周口人,講師,碩士,主要從事食品與發(fā)酵工程的教學(xué)與研究工作.