張可鋒，朱華，高雅，鄒登峰（.桂林醫(yī)學(xué)院，桂林市54004；.廣西中醫(yī)學(xué)院，南寧市53000）

狗肝菜為爵床科植物狗肝菜Dicliptera chinensis（L.）Nees的全草，其味苦、性寒，具有清熱、涼血、利尿、解毒等功效，臨床常用于治療熱病斑疹、便血、溺血、小便不利、腫毒疔瘡等證。有文獻(xiàn)報道，狗肝菜主要含有多糖、有機(jī)酸、氨基酸等物質(zhì)[1]，其中多糖具有保肝降酶的活性[2]，但對狗肝菜多糖的提取工藝研究國內(nèi)外尚未見報道。本研究采用單因素和L9（34）正交試驗法考察提取時間、溫度、次數(shù)和料液比對狗肝菜多糖得率的影響，以期為狗肝菜活性成分的進(jìn)一步研究與資源應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-2550紫外-可見分光光度計（日本島津公司）。狗肝菜藥材采自廣西中醫(yī)學(xué)院藥用植物園，經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院藥用植物教研室韋松基教授鑒定為真品。葡萄糖（廣東汕頭市西隴化工廠，批號：0703151）；苯酚、硫酸、乙醇、石油醚（30～60℃）、丙酮、乙醚及其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 狗肝菜多糖的提取

稱取干燥的狗肝菜全草粗粉100 g，加入適量石油醚脫脂，無水乙醇除雜，各回流提取2 h。藥渣揮盡乙醇后沸水提取2次，每次1.5 h，合并提取液，濃縮至100 mL，氯仿-正丁醇（4∶1）多次萃取（即Sevag法），除去蛋白質(zhì)，加95%乙醇使醇含量達(dá)到80%，于4℃冰箱中醇沉12 h。抽濾，濾渣依次用乙醚、無水乙醇、丙酮洗滌，即得狗肝菜多糖。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖250 mg，蒸餾水溶解后定容至100 mL。準(zhǔn)確吸取此溶液1 mL，置于25 mL量瓶中 ，稀釋至刻度，搖勻（含葡萄糖100 μg·mL-1），備用。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于具塞試管中，用蒸餾水補(bǔ)充至2 mL，以蒸餾水作空白，每管加入5%苯酚溶液1 mL，再垂直快速加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，沸水加熱15 min，之后用流水速冷至室溫，于487 nm波長處測定吸光度（A）。以檢測濃度（C）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝0.007 74C+0.036 38（r＝ 0.999 4）。結(jié)果表明，狗肝菜多糖檢測濃度在20～70 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.4 換算因子的測定

準(zhǔn)確稱取多糖20 mg，溶于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻。準(zhǔn)確吸取此溶液1 mL，置于具塞試管中，按“2.3”項下方法測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算多糖溶液中葡萄糖的濃度，按下式計算出換算因子：f＝W/（C·D）。式中，W為多糖質(zhì)量（mg）；C為多糖濃度（μg·mL-1）；D為稀釋倍數(shù)。

2.5 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取生藥狗肝菜1 g，以石油醚脫脂，水煎煮法提取，醇沉、減壓干燥，按“2.9”項下方法提取操作。精密稱定各提取物質(zhì)量20 mg，然后加水定容至250 mL，作為樣品溶液。

2.6 多糖含量的測定[3]

精密吸取供試品溶液2 mL，置于具塞試管中，按苯酚-濃硫酸法，照“2.3”項下方法測定吸光度，由回歸方程計算供試品溶液中葡萄糖濃度，按公式：含量（%）＝（C?D?f/W）×100%，計算供試品中多糖的含量；多糖得率（%）＝多糖含量×干燥提取物質(zhì)量（g）/原料質(zhì)量（g）。其中，C為樣品液中葡萄糖的濃度；D為稀釋因素；f為換算因子；W為樣品質(zhì)量。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取6份空白基質(zhì)各5 g，分別加入精制多糖10 mg，按“2.5”項下供試品溶液的方法制備和“2.3”項方法操作測定，測定吸光度，計算加樣回收率和RSD，結(jié)果分別為98.58%、2.19%。

2.8 精密度試驗

取樣品液2 mL，按“2.3”項方法測定5次，測定吸光度，結(jié)果RSD＝0.51%。

2.9 試驗條件的優(yōu)化

2.9.1 單因素分析試驗 （1）提取時間對狗肝菜多糖得率的影響：以料液比1∶15、溫度90℃，提取2次，用85%的乙醇沉淀，不同的提取時間（1、1.5、2.0、2.5 h）多糖得率分別為2.30%、2.62、2.86%、2.87%。可見提取2.0 h多糖得率相對較高，隨著時間的延長，多糖得率不再增加，考慮其狗肝菜中多糖的含量是一定的，在其它條件不變下延長時間狗肝菜藥材中一些其它的成分會被提取出來，干擾多糖的檢測結(jié)果。（2）提取次數(shù)對狗肝菜多糖得率的影響：選擇不同提取次數(shù)（1、2、3），以1∶15的料液比，在90℃下提取2.0 h，用85%的乙醇沉淀，多糖得率分別為2.70%、2.98%、3.01%?？梢?，提取3次多糖的得率相對較高，但提取2次和3次得率相差不多，從工藝及操作上考慮選擇提取2次。（3）提取溫度對多糖得率的影響：以料液比1∶15，提取2次，每次2.0 h，用85%的乙醇沉淀，不同的提取溫度（80、85、90、95℃）多糖得率分別為2.80%、2.83%、2.85%、2.86%。可見提取溫度90℃多糖得率相對較高，隨著溫度升高，多糖得率不再增加。（4）料液比對狗肝菜多糖得率的影響：選擇不同的料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25），溫度為 90 ℃，提取2次，每次2.0 h，用85%的乙醇沉淀，結(jié)果多糖得率分別為2.72%、2.81%、2.84%、2.86%?？梢婋S著料液比增大，多糖得率不斷增加，在料液比1∶20以上時，多糖得率增加緩慢。（5）醇沉濃度對狗肝菜多糖得率的影響：以1∶20的料液比，在90℃下提取2次，每次2 h，選擇不同醇沉濃度（80%、85%、90%），結(jié)果多糖得率分別為3.08%、3.10%、3.10%。可見80%以上乙醇對狗肝菜多糖沉淀度影響不大。考慮節(jié)省原料，在工藝中選擇80%的乙醇沉淀即可。

2.9.2 正交試驗 通過對提取時間、溫度、次數(shù)、料液比和醇沉濃度這5個因素進(jìn)行分析，根據(jù)單因素分析結(jié)果，從中選取提取時間（A）、提取次數(shù)（B）、提取溫度（C）、料液比（D）4個因素，采用L9（34）表進(jìn)行正交試驗，以狗肝菜多糖得率為指標(biāo)確定最佳提取工藝。因素水平見表1；正交試驗結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

由表2、表3可知，影響因素的主次順序為A＞D＞B＞C，C為非主要因素，考慮能源，選擇提取溫度為85℃，故狗肝菜多糖最佳提取工藝為A3B2C1D3，即提取時間2 h，提取2次，溫度85 ℃，料液比1∶20。

2.9.3 驗證試驗 按正交試驗的優(yōu)化條件對3批狗肝菜藥材進(jìn)行提取工藝驗證，結(jié)果多糖含量和得率的平均值分別為（5.12±0.11）%和（3.26±0.3）%。3次差異較小，工藝穩(wěn)定。

3 討論

本文測定多糖含量方法的原理是先用無水乙醇除去單糖、低聚糖及其它干擾性成分，再用水提醇沉法得到多糖。多糖在濃硫酸的作用下水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后和苯酚縮合成橙黃色化合物，且顏色穩(wěn)定，該化合物顏色深淺與糖的濃度成正比。因狗肝菜采收產(chǎn)地、季節(jié)等因素，其多糖含量會有差異，但多糖含量可作為其質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。此外，今后應(yīng)加強(qiáng)以多糖為活性成分的藥理實驗研究。

由于多糖在空氣中易氧化使顏色加深，故在過濾過程中分別依次用乙醚、無水乙醇、丙酮多次洗滌，消除了這種變化，而后真空干燥可得狗肝菜多糖。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1977：1 424.

[2]李海燕，王旭深.狗肝菜多糖保肝作用研究[J].中藥材，2006，29（8）：833.

[3]侯劍萍，王春霞.牛膝多糖的提取純化工藝研究[J].中國藥房，2008，19（36）：2 822.