謝靈瑤，楊俊卿，黃 硯（重慶醫(yī)科大學藥學院藥理學教研室，重慶市 400016）

環(huán)氧化酶（Cyclooxygenase，COX）是催化花生四烯酸（Arachidonic acid，AA）生成系列前列腺素衍生物（Prostaglandins，PGs）的限速酶，COX可分為結構型COX-1和可誘導型COX-2。越來越多的研究[1，2]證明炎癥因子COX-2在造成腦損傷過程中有著十分重要的位置，且在炎癥或損傷時，COX-2在神經(jīng)元上高表達。另有研究[3]表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥因子PGs及COX-2的表達與神經(jīng)元損傷退變有密切關系，它們參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程。美洛昔康是COX-2選擇性抑制劑。本課題組前期研究[4，5]表明，美洛昔康對鋁負荷所致急、慢性腦組織損傷具有明顯的改善作用，但由于在體實驗影響因素較多，為進一步證實美洛昔康對腦損傷的保護作用，本文采用海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)，在細胞水平觀察美洛昔康對鋁鹽致神經(jīng)元損傷的作用，并且初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試藥

新生24 h內SD（Sprague-Dawley）乳鼠，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（渝）2002000。

美洛昔康（昆山龍燈瑞迪制藥有限公司，批號：07050，純度：100.5%）；DMEM/F12培養(yǎng)基（批號：1361834）、B27培養(yǎng)基（批號：1290007）均由美國Gibco公司提供；特級胎牛血清（天津灝洋公司，批號：XA070621HY）；多聚-L-賴氨酸（批號：AR0003）、MTT（批號：SP1090，使用時以磷酸鹽緩沖液（PBS）制備成5 mg·mL－1溶液備用）均由美國Sigma公司提供；兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）多克隆抗體（批號：BA0535）、抗體稀釋液（批號：AR1016）均由武漢博士德生物工程有限公司提供；免疫組化SP（Streptavidin-perosidase）試劑盒（批號：K86922E）、DAB（3，3′-diaminobenzidine）顯色劑（批號：375230AJ）均由北京中杉生物技術有限公司提供；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號：20090226）、超氧化物岐化酶（SOD）試劑盒（批號：20090318）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號：20090318）均由南京建成生物工程研究所提供；氯化鈉（NaCl）、六水三氯化鋁（AlCl3·6H2O）均為國產分析純。

1.2 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)

出生24 h內的乳鼠，以75%乙醇消毒后分離出海馬，盡量除去血管，以D-Hank’s液洗3次，放入冰袋上裝有D-Hank’s的燒杯中，用眼科剪將組織盡量剪碎。加入5倍組織體積的0.125%胰酶，37℃消化30 min，期間每10 min振搖1次。加入等體積的20%培養(yǎng)液終止消化。200目細胞篩過濾。取細胞懸液800 r·min－1離心8 min，除去胰酶。2次離心后，加入一定量的20%培養(yǎng)液分散沉淀，配成細胞密度為每升1×106個的細胞懸液，種植于賴氨酸處理過（爬片浸于賴氨酸溶液中2 h，超凈臺內風干備用）的24孔板或96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h神經(jīng)元貼壁后，換B27無血清培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每2 d半量換液1次，神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天可以長到較好的狀態(tài)。

1.3 NSE免疫細胞化學鑒定

取24孔板中培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元爬片（10 mm×10 mm），PBS洗3次，用95%乙醇固定40 min后，按下列操作順序進行：（1）PBS洗3次，每次5 min；（2）3%H2O2去離子水孵育20 min；（3）PBS洗3次，每次5 min；（4）正常山羊血清工作液中孵育1 h；（5）NSE多克隆抗體-抗體稀釋液（1∶75）滴于爬片上細胞表面，4 ℃放置過夜；（6）PBS洗3次，每次5 min；（7）生物素標記羊抗兔IgG中孵育2 h；（8）PBS洗3次，每次5 min；（9）辣根酶標記鏈霉卵白素工作液中孵育20 min；（10）PBS洗3次，每次5 min；（11）DAB 顯色，10 min；（12）流水終止染色 10 min；（13）反應終止后，加入蘇木精復染細胞核。胞漿內成彌漫性棕色，胞核著色藍色者為神經(jīng)元。

1.4 MTT法測定

96孔板中大鼠神經(jīng)元培養(yǎng)第7天后分成空白對照組、鋁模型組、美洛昔康大、中、小劑量組?？瞻讓φ战M加入200 μmol·L－1的NaCl培養(yǎng)液，鋁模型組加入200 μmol·L－1的AlCl3培養(yǎng)液，美洛昔康小、中、大劑量組分別加入200 μmol·L－1的AlCl3+10－8mol·L－1、10－7mol·L－1、10－6mol·L－1的美洛昔康（均為終濃度）。在藥物作用24 h后，每孔加入5 mg·mL－1的MTT溶液20 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，除去上清液，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）振蕩以溶解結晶。于570 nm波長處讀取光密度（OD）值，從OD值判斷神經(jīng)元存活力高低，OD值越高，神經(jīng)元存活力越高。

1.5 LDH活性測定

接種于24孔培養(yǎng)板的海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天，藥物處理及分組同“1.4”項方法。在加入藥物處理作用24 h后，收集培養(yǎng)液上清0.03 mL（設為A溶液），用于測定釋放入培養(yǎng)液的LDH總活性。再用胰酶消化各孔細胞，加入生理鹽水1 mL，超聲波細胞粉碎機破碎細胞（冰上進行）1 min，低溫離心收集上清液0.03 mL（設為B溶液），用于測細胞內的LDH總活性。測定方法按照LDH測定試劑盒中操作說明書進行。于440 nm波長處檢測OD，計算LDH活性和漏出率：LDH活性（IU·g－1prot）＝（測定管OD值－測定空白管OD值）/（標準管OD值－標準空白管OD值）×2（μmol·mL－1）/蛋白濃度（mg·mL－1）；LDH漏出率＝A溶液LDH活性/（A溶液LDH活性+B溶液LDH活性）×100%。蛋白定量采用考馬斯亮藍法。通過計算LDH漏出率判斷神經(jīng)元損傷情況，LDH漏出率越高，說明神經(jīng)元損傷越明顯。

1.6 SOD活性和MDA含量測定

接種于24孔培養(yǎng)板的海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天，藥物處理及分組同“1.4”項方法。在藥物作用24 h后，加入胰酶消化細胞，加入生理鹽水220 μL，低溫下超聲波破碎細胞、收集上清液0.2 mL，分別按SOD、MDA試劑盒中操作說明書進行測定，測定波長分別為550、532 nm，SOD活性、MDA含量計算公式如下：SOD活性（IU·mg－1prot）＝（對照管OD值－測定管OD值）/對照管OD/50%×反應液總體積/取樣量（mL）/蛋白含量（mg·mL－1）；MDA含量（nmol·mg－1prot）＝（測定管OD值－測定空白管OD值）/（標準管OD值－標準空白管OD值）×10（nmol·mL－1）/蛋白濃度（mg·mL－1）。蛋白定量采用考馬斯亮藍法。

1.7 神經(jīng)元病理形態(tài)學觀察

接種于置有載玻片（10×10 mm）的24孔培養(yǎng)板的海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天，藥物處理及分組同“1.4”項方法。取藥物作用24 h后的神經(jīng)元爬片，PBS洗3次，95%乙醇固定40 min，中性樹脂固定，PBS沖洗3次，HE染色，光鏡下觀察神經(jīng)元病理形態(tài)學變化。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 NSE鑒定結果

倒置相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)7 d的神經(jīng)細胞胞體飽滿，樹突與軸突明顯，細胞突起連接成網(wǎng)狀。NSE免疫細胞化學染色后，陽性細胞胞體及軸突呈棕黃色，蘇木精復染后細胞核呈藍色。隨機計數(shù)100個細胞中NSE陽性細胞數(shù)，陽性百分率超過95%，見圖1。

圖1 原代大鼠海馬NSE免疫鑒定Fig1 Immunocytochemistry staining of NSE in primary cultured hippocampal neurons in rats

2.2 MTT法結果

各組OD值見表1。

表1 各組OD值比較（±s）Tab 1 Comparison of OD value in each group（±s）

表1 各組OD值比較（±s）Tab 1 Comparison of OD value in each group（±s）

與空白對照組比較：＊P＜0.01；與鋁模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01compared with blank control group：＊P＜0.01；compared with aluminum model group：#P＜0.05，##P＜0.01

OD 0.76±0.05 0.58±0.05＊0.64±0.03#0.67±0.06#0.69±0.06##組別空白對照組鋁模型組美洛昔康小劑量組（10－8mol·L－1）美洛昔康中劑量組（10－7mol·L－1）美洛昔康大劑量組（10－6mol·L－1）n6 6 6 6 6

由表1可見，與空白對照組比較，鋁模型組OD值明顯降低（P＜0.01）。與鋁模型組比較，美洛昔康小劑量組、中劑量組OD值顯著升高（P＜0.05），而大劑量組OD值升高更明顯（P＜0.01），提示美洛昔康各劑量組神經(jīng)元存活力提高。

2.3 LDH活性測定

各組LDH漏出率結果見表2。

由表2可見，與空白對照組比較，鋁模型組LDH漏出率明顯升高（P＜0.01）。與鋁模型組比較，美洛昔康小劑量組LDH漏出率顯著降低（P＜0.05），而中劑量組、大劑量組的顯著性差異更明顯（P＜0.01）。說明美洛昔康各劑量組能減少神經(jīng)元的損傷。

表2 各組LDH漏出率比較（±s）Tab 2 Comparison of LDH leakage in each group（±s）

表2 各組LDH漏出率比較（±s）Tab 2 Comparison of LDH leakage in each group（±s）

與空白對照組比較：＊P＜0.01；與鋁模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01compared with blank control group：＊P＜0.01；compared with aluminum model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組鋁模型組美洛昔康小劑量組（10－8mol·L－1）美洛昔康中劑量組（10－7mol·L－1）美洛昔康大劑量組（10－6mol·L－1）n6 6 6 6 6 LDH漏出率/%17.13±5.02 35.70±6.02＊28.00±5.49#23.33±4.02##19.20±4.12##

2.4 SOD活性、MDA含量

各組SOD活性和MDA含量測定結果見表3。

表3 各組SOD活性及MDA含量比較（±s）Tab 3 The activity of SOD and content of MDA in each group（±s）

表3 各組SOD活性及MDA含量比較（±s）Tab 3 The activity of SOD and content of MDA in each group（±s）

與空白對照組比較：＊P＜0.01；與鋁模型組比較：#P＜0.01compared with blank control group：＊P＜0.01；compared with aluminum model group：#P＜0.01

組別空白對照組鋁模型組美洛昔康小劑量組（10－8mol·L－1）美洛昔康中劑量組（10－7mol·L－1）美洛昔康大劑量組（10－6mol·L－1）n 6 6 6 6 6 SOD/IU·mg－1prot 76.55±5.28 45.58±7.29＊69.55±4.62#70.72±5.08#77.19±3.67#MDA/nmol·mg－1prot 2.11±0.62 4.13±0.61＊2.78±0.63#1.97±0.60#1.49±0.40#

由表3可見，與空白對照組比較，鋁模型組SOD活性明顯降低、MDA含量明顯升高（P＜0.01）。與鋁模型組比較，美洛昔康各劑量組SOD活性明顯升高、MDA含量明顯降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性。

2.5 神經(jīng)元病理形態(tài)學

各組神經(jīng)元病理形態(tài)學光鏡下觀察結果見圖2。

由圖2可見，空白對照組的海馬神經(jīng)元結構完整、清晰，細胞數(shù)目多，突起明顯，連接成網(wǎng)。鋁模型組的神經(jīng)元細胞數(shù)目明顯減少，突起萎縮，有部分神經(jīng)元聚集在一起，甚至破裂死亡。美洛昔康各劑量組與鋁模型組比較神經(jīng)元數(shù)目增加，胞體和突起結構明顯改善。

3 討論

隨著全球人口老齡化的趨勢越來越明顯，以阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）等為代表的神經(jīng)元退行性疾病越來越引起人們的廣泛關注。

鋁元素是目前公認導致體內氧化應激反應的重要因素之一，也是引起AD等老年性癡呆的重要誘因。鋁是一種可在大腦內誘導生成自由基的神經(jīng)毒性介質，而自由基的不斷累積會使細胞膜和蛋白質變性，神經(jīng)元死亡，從而引起如AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。由于鋁所引起的神經(jīng)生化變化與AD患者的神經(jīng)化學變化相似，因此實驗中常采用鋁鹽建立體內和體外神經(jīng)元損傷模型。MTT法間接反映的是活細胞數(shù)量的多少，其活細胞數(shù)量與檢測出來的OD值呈正比；而LDH的漏出率反映的是細胞受損的情況，LDH漏出率越大，說明細胞受損越嚴重。SOD可以清除機體內自由基，從而保護細胞免受損傷，因此SOD活性的強弱間接反映了機體清除氧自由基的能力。MDA的含量反映機體內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度，所以MDA含量的高低反映的是細胞受自由基攻擊的嚴重程度。

圖2 各組神經(jīng)元病理形態(tài)學觀察（HE染色，×200）Fig 2 Pathomorphology of neurons in each group（HE staining，×200）

NSE是位于神經(jīng)元胞漿內的一種可溶性酸性蛋白，是神經(jīng)元特異性標志物之一。原代神經(jīng)元培養(yǎng)7 d時進行鑒定，神經(jīng)元純度達到95%，故可以用于進行原代神經(jīng)元的實驗研究。本課題中，筆者采用鋁鹽（200 μmol·L－1）處理原代培養(yǎng)神經(jīng)元24 h，以病理形態(tài)學、MTT、LDH為觀察指標，體外模擬鋁鹽致神經(jīng)元損傷模型。結果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，模型組神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，突起變短，MTT值和SOD活性降低，LDH漏出率和MDA含量明顯升高，提示筆者的模型建立是成功的，可以用于神經(jīng)元損傷的機制研究以及藥物作用的觀察。

有報道[6，7]COX-2抑制劑Rofecoxib和Celecoxib對興奮毒所致腦損傷、神經(jīng)元退變有明顯保護作用。同時有研究[8]證明Aβ1-40肽在成神經(jīng)瘤細胞中的聚集會誘導COX-2的表達，且增強COX-2的活性，導致炎癥反應進一步嚴重，因此COX-2在以AD為代表的神經(jīng)元退變疾病中有著十分密切的關系。在本體外細胞實驗中筆者發(fā)現(xiàn)，美洛昔康能劑量依賴性改善鋁負荷導致的神經(jīng)元胞體和突起的損傷、增加神經(jīng)元數(shù)目，不同程度地提高MTT值，降低LDH漏出率，同時增強細胞內SOD活性、降低MDA含量。本研究結果從細胞水平進一步證實了美洛昔康對于因鋁負荷導致原代神經(jīng)元的損傷有著明顯的保護作用。

美洛昔康改善鋁負荷導致的離體大鼠海馬神經(jīng)元損傷的機制則可能是由于其抑制了COX-2活性，減少了炎癥性因子前列腺素的合成，降低了炎癥反應，進而抑制氧化應激反應，從而發(fā)揮對損傷神經(jīng)元的保護作用。

本實驗結果表明，美洛昔康對于鋁鹽導致的神經(jīng)元損傷具有一定的保護作用。而以美洛昔康為代表的COX-2抑制劑對于一些神經(jīng)元退變疾病如AD等，可能有一定的臨床應用前景。

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