劉全國，馬貴平，李炎鑫，史喜菊，李冰玲

（北京出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，北京 101113）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株的來源

選擇羊癢病金黃地鼠標準毒株GSH 263 K（此標準株來自美國HIH實驗室，已穩(wěn)定成功傳代多年[1]）作為動物感染實驗的移植物。

1.1.2 試劑

100 mM苯甲基磺酰氟（PMSF，Boehringer）；10%sarcosyl，0.1%sarcosyl，1 mg/mL蛋白酶 K（PK，Merk公司）；10%和20%蔗糖溶液；80%甲酸，蛋白含量分析試劑盒BICINCHONINIC ACID PROTEIN ASSAY KIT（Sigma Procedureno.TPRO-562），PVDF膜（Millipore公司）；ECL W.B.顯色劑（美國Santa Cruz公司）；Nonidet P-40，脫氧膽酸鈉（Fluka），Nu-PAGE Bis-Tis Gel，4X NuPAGE LDS Sample buffer，NuPAGE Sample Reducing Agent，NuPAGEMOPSSDS電泳緩沖液（Invitrogen life technologies）；抗朊病毒（Prion）單克隆抗體6H4識別人PrP氨基酸序列144-152（瑞士Prionics AG）；HRP標記的羊抗鼠IgG（美國Jackson ImmunoResearch Laboratories，INC.公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要設(shè)備

美國Beckman Advanti J-25固定角高速冷凍離心機；美國Beckman XL-70水平角超速冷凍離心機；德國EPPENDORF 5810R微量冷凍離心機；瑞士PT-MR2100電動勻漿機；美國Virtis-100超聲破碎儀；法國GE公司TE70半干轉(zhuǎn)印儀；美國Invitrogen垂直電泳儀；美國伯樂公司CHemiDOC-XR化學發(fā)光熒光凝膠成像分析系統(tǒng)；柯達X-OMAT1000全自動洗片機；日本島津紫外可見分光光度計；芬蘭Labsystems水平震蕩器；德國BRAND公司電動移液控制器；德國SATORIOVS公司萬分之一電子天平；美國LABCONCO抗酸性離心濃縮儀；日本三洋SIM-F124制冰機；美國LABCONCO二級A2型生物安全柜；美國二級生物安全柜NU-440A/B3；美國 REVCO ULT-1786-3超低溫冰箱；美國AMERSHAM BIOSCIENCES FRAC 920蛋白純化儀。

1.1.4 主要溶液與配制

裂解液:10 mM Tris HCl（pH7.4）+100 mM NaCl+0.5%NP+40+0.5%脫氧膽酸鈉 +10mM EDTA；TBS：10mM Tris+10%NaCl+1%sarcosyl（pH7.4）；Buffer A:25mM Tris-HCl（pH8.0）+5 mM EDTA；Buffer B:6 M Gdn-HCl+12.5 mM TrisHCl+5 mM DTT+1 mM EDTA。

1.2 方法

1.2.1 動物感染試驗 25只四周齡雌性金黃地鼠，用10%GSH 263 K株金黃地鼠大腦組織勻漿作為移植物，腹腔注射100μL進入金黃地鼠體內(nèi)，另三只同齡正常金黃地鼠腹腔注射100μL PBS作為陰性對照。實驗廢棄物需經(jīng)2 N強堿或22 000 ppm有效氯處理兩小時，再進行兩個循環(huán)的蒸汽134℃高壓滅菌處理，確保實驗室生物安全。

1.2.2 臨床診斷 腹腔注射263 K株的金黃地鼠與陰性對照在臨床前期并無區(qū)別，但是經(jīng)過105 d孵育后，腹腔注射263 K株的金黃地鼠表現(xiàn)出臨床癥狀。臨床一期表現(xiàn)出對突然金屬撞擊聲及強光照射特別敏感。臨床二期表現(xiàn)出走路不穩(wěn)，聽到金屬撞擊聲時易跌倒或從高空墜地時站立不穩(wěn)。臨床末期顯示出明顯的后肢拖地，摔倒后無法站立，腹部向上，要靠外力才能行走，直至失去行動能力而死亡。病程從臨床一期至臨床末期約十天至兩周。陰性對照金黃地鼠兩年內(nèi)不顯示臨床癥狀。

1.2.3 常規(guī)病理組織學診斷 取正常金黃地鼠和染病金黃地鼠的大腦、小腦組織，10% 福爾馬林固定，甲酸處理1 h，自來水充分沖洗，石蠟包埋，制成5μm的切片進行蘇木素-伊紅染色（H·E染色），檢查灰質(zhì)神經(jīng)元有無海綿狀變性，神經(jīng)元核周體有無單個或多個空泡，星形膠質(zhì)細胞是否肥大增生。

免疫組織化學法診斷（IHC）：IHC檢測按馬貴平已發(fā)表的方法檢查病理組織切片中有無病理性朊蛋白顆粒[2-3]。大腦和小腦組織做成切片，先在切片上滴加第一抗體（鼠抗PrP單克隆抗體FH11），第二抗體為標記有生物素（Biotin）的馬抗鼠血清。若病理組織切片中有病理性朊蛋白，就會與第一抗體結(jié)合，隨后與第二抗體結(jié)合。再加入ABC（Avidin+Biotin-Peroxidase Complex）試劑，后者可結(jié)合到第二抗體上。之后再加入底物AEC，即可出現(xiàn)顏色反應(yīng)。最后用蘇木素復染，病理性朊蛋白呈紅色。陰性對照用PBS代替一抗加在羊瘙癢病腦組織切片上。

1.2.4 免疫印跡分析診斷 樣品處理按李運敏[4]已發(fā)表的方法處理，即以預冷的裂解液將50 mg腦組織制成10%的勻漿，1400r/min離心1min，以除去細胞碎片。上清液里加入15 μg/mL的蛋白酶K，37℃消化1 h，立即加入2mM/LPMSF終止反應(yīng)。所有的腦組織勻漿液都與二倍4%SDS載樣緩沖液1:1混合，置于沸水浴中10 min，上樣于12%NUPAGEGel進行分離。電泳結(jié)束后，用Tank Transf Unit（Invitrogen）在室溫恒定電流160mA條件下轉(zhuǎn)移1h，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉PBS-Tween 20溶液37℃封閉1h。加第一抗體1:5000稀釋，過夜孵育，充分洗滌PVDF膜，加第二抗體1:3 000稀釋，將膜置于其中37℃作用2 h，最后用Santa Cruz Western blotting chemilumines-cence luminol reagent顯示印跡結(jié)果。

1.2.5 腦組織的選擇 自2005年10月開始，選取25只四周齡雌性金黃地鼠，腹腔感染注射100μL的10%263 K株腦組織勻漿，100天后相繼出現(xiàn)臨床癥狀，在臨床末期處死動物取腦組織，經(jīng)過常規(guī)病理組織學診斷、免疫組織化學法診斷和免疫印跡分析診斷等確診實驗后，將所有陽性動物大腦組織混在一起，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 病理性朊蛋白標準物質(zhì)制備步驟 第一天，取20 g羊瘙癢病263 K株金黃地鼠大腦組織在80 mL 10%sarcosyl溶液中勻漿，然后室溫靜置30 min，之后在20℃高速（22 000 g或17 000 r/min）離心30min。收集上液在20℃超速（215 000 g或50 000 r/min）離心3 h，收集沉淀在TBS溶液中超聲，定容終體積至20 mL，室溫過夜。第二天再次超聲處理，然后在20℃超速（215 000 g或 50 000 r/min）離心4 h，收集沉淀在1 mL TBS溶液中超聲，在37℃旋渦混合2 h，然后轉(zhuǎn)移至2 mL微離心管在4℃離心（14 000 r/min）20 min，收集沉淀在1 mL TBS溶液中超聲，然后加10μL 1 mg/mL的蛋白酶K溶液，在37℃旋渦混合2 h，在4℃微量離心（14 000 r/min）20 min，收集沉淀，加 0.1%sarcosyl和2μL的100mM PMSF，置冰上超聲，最后靜置在4℃過夜。第三天，超聲后在37℃旋渦混合1h，再用0.1%sarcosyl稀釋至10mL，同時準備各5 mL的10%、20%蔗糖溶液梯度，在20℃蔗糖梯度超速（215 000 g或50 000 r/min）離心 5 h，收集沉淀并保存在-80℃。

1.2.7 滅活處理 經(jīng)過三天制備的沉淀物在80%甲酸溶液中超聲之后，在4℃條件旋渦混合滅菌3 h，在4℃條件微量離心（14 000 r/min）20 min，收集上清，真空離心干燥，加500 μL三蒸水洗滌兩次，真空離心干燥后保存在-80℃。

2 結(jié)果

2.1 病理性朊蛋白標準物質(zhì)的均勻性研究

根據(jù)國家標準物質(zhì)技術(shù)規(guī)范，按標準物質(zhì)制備程序進行了標準物質(zhì)均勻性檢驗。從已經(jīng)分裝好的純化的標準物質(zhì)隨機取8瓶物質(zhì)作為基本對比物質(zhì)，其中取6份，每份10μL；另選10瓶作為檢查物質(zhì)，從中各取3份，每份20μL，用BICINCHONINIC ACID PROTEIN ASSAY KIT（Sigma Procedure No.TPRO-562）法進行測定，將兩組測定結(jié)果分別進行，結(jié)果表明，檢查物質(zhì)組和對比物質(zhì)組無顯著性差異。

BCA法蛋白定量試劑盒（BCA Protein Assay）原理簡介：BCA（bicinchoninic acid）法蛋白濃度定量試劑盒是世界上常用的蛋白濃度檢測方法之一。眾所周知，二價銅離子在堿性條件下，可以被蛋白質(zhì)還原成一價銅離子（biuret reaction），一價銅離子和獨特的BCA Solution A（含有BCA）相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個銅離子，形成紫色的反應(yīng)復合物。該水溶性復合物在562 nm處顯示強烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，因此根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。

總蛋白含量測定：現(xiàn)配制蛋白檢測試劑即一份Copper II混合50份Bicinchoninic Acid溶液，然后按照下表測量標準蛋白在562nm吸收值。

繪制標準曲線：根據(jù)標準蛋白在562 nm吸收值繪制標準曲線，再根據(jù)標準曲線，計算待測樣品蛋白含量。

圖1顯示標準曲線的R2等于0.9983，表明標準曲線的線性值非常好，符合實驗要求。

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表1第一批檢測結(jié)果表明8瓶樣品的標準偏差為0.003，說明8瓶樣品沒有顯著差。表2檢測結(jié)果表明另一批10瓶樣品的標準偏差為0.0029，說明10瓶樣品也沒有顯著差，兩次測定結(jié)果都表明本次制備的標準物質(zhì)均勻性很高，符合國家標準物質(zhì)準備要求。

2.2 病理性朊蛋白標準物質(zhì)的穩(wěn)定性研究

標準物質(zhì)的穩(wěn)定性是標準物質(zhì)的另一重要性質(zhì)，是使標準物質(zhì)具有時間一致性的前提。標準物質(zhì)的穩(wěn)定性，是指在規(guī)定的保管、儲存和使用條件下，在規(guī)定的時間間隔內(nèi)，使其描述的特性值保持在規(guī)定范圍內(nèi)的能力。通常對標準物質(zhì)長時間連續(xù)觀察其量值變化規(guī)律而確定的。

病理性朊蛋白具有很高的熱穩(wěn)定性，Steele PJ和Taylor D M用羊癢病感染263 K和301 V株[5]，經(jīng)200℃高溫處理1 h，仍有部分感染力。Brown P和Gajdusek DC在360℃高溫處理1 h 263 K株腦組織[6]，仍存在感染力。鑒于病理性朊蛋白具有很高的熱穩(wěn)定性，在-80℃保存、-20℃保存、4℃保存、在室溫條件、甚至121℃高壓滅菌條件，病理性朊蛋白均有很好的穩(wěn)定性。因此將所制備的純品保存在 -80℃、-20℃、4℃保存、室溫，以1年期為限進行穩(wěn)定性研究，對所研制的標準物質(zhì)進行蛋白質(zhì)免疫印跡雜交方法測定。1μL的樣品與二倍4%SDS載樣緩沖液1:1混合，再1:10稀釋兩次后，置于沸水浴中10 min，上樣于12%NUPAGE Gel進行分離。電泳結(jié)束后，用Tank Transf Unit（Invitrogen）在室溫恒定電流160 mA條件下轉(zhuǎn)移1 h，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉PBS-Tween 20溶液37℃封閉 1 h。加第一抗體6H4單克隆抗體1:5 000稀釋過夜孵育，充分洗滌PVDF膜，加辣根過氧化物酶連接的第二抗體1:3 000稀釋，將膜置于其中37℃作用2 h，最后用Santa Cruz Western blotting chemiluminescence luminol reagent顯示蛋白印跡結(jié)果。實驗結(jié)果表明，在選擇的測定期限內(nèi)本標準品是穩(wěn)定的，符合標準物質(zhì)穩(wěn)定性的有關(guān)國家標準要求（圖2）。

2.3 病理性朊蛋白標準物質(zhì)的定值

利用蛋白純化儀對純化蛋白進行定值具有安全、經(jīng)濟、快捷、步驟簡便、定值準確可靠且重現(xiàn)性好等特點，待測樣品加載前需進行滅活處理，利用本室Amersherm Biosciences AKTA FPLC Purifer with Frac 920蛋白純化儀配高壓輸液泵，采用高靈敏檢測器，梯度洗脫裝置，樣品自動收集可收集（收集管直徑為10～18 mm）直到96份，實時UV-900監(jiān)視，經(jīng)過全自動蛋白純化儀純化，可得到高度純化并且具有生物活性的目的蛋白，再以峰面積歸一化法進行樣品純度的測定。

制備的病理性朊蛋白標準物質(zhì)約0.25 mg的樣品，將其懸浮于500 μL Buffer A，樣品混合液在100℃加熱變性3 min后，注入COLUMN XK16/20柱分離，用Buffer B洗脫，設(shè)定流速為0.25 mL/min室溫洗脫，洗脫收集150 min，利用UV在A280監(jiān)測（圖 3），樣品經(jīng) Centricon 30（Amicon）濃縮。

峰面積歸一化法即假設(shè)樣品各組分有相同物理化學性質(zhì)，因此各組分單位峰面積有相同的質(zhì)量。面積歸一化法就是把所有峰的面積之和看作100%，計算每個單峰的面積占總峰面積的百分數(shù)。經(jīng)三次純度測定，此次制備的標準物資的純度可達99.71%，達到國際同類標準物質(zhì)純度水平，符合標準物質(zhì)技術(shù)規(guī)范的要求[7-8]。

3 討論

瘋牛病和羊癢病屬我國一類進境傳染病，由于我國檢測機構(gòu)缺乏此類病料及有關(guān)檢測用標準物質(zhì)，因此為防控傳入性重大動物疫病，對此類重大動物疫病的診斷迫切需要制備檢驗評價用標準物質(zhì)。

金黃地鼠羊癢病263 K株已成為分離病理性朊蛋白標準物質(zhì)的最重要的標準株，選擇標準株263 K來制備病理性朊蛋白，動物發(fā)病周期短，病毒含量高。利用發(fā)病末期的腦組織，經(jīng)一系列離心和洗滌步驟以及蛋白酶K處理后，可制備成高純度的病理性朊蛋白。標準物質(zhì)的均勻性是對標準物質(zhì)樣品總體空間分布的一種評價，它是標準物質(zhì)研制的重要內(nèi)容之一。通常，標準物質(zhì)均勻性是指特殊量值在空間分布的均勻程度。均勻性是標準物質(zhì)第一位和最根本的要求，是保證標準物質(zhì)具有空間一致性的前提。本文研制的金黃地鼠羊癢病病理性朊蛋白標準物質(zhì)是水的懸浮液，而水的懸浮液樣品在超聲波作用下是很容易混合均勻的。金黃地鼠羊癢病病理性朊蛋白標準物質(zhì)穩(wěn)定性很好，凍干保存在低溫或室溫時不影響其穩(wěn)定性，但是溶解后的使用液根據(jù)我們的實驗數(shù)據(jù)顯示，短期內(nèi)（1～2周）其穩(wěn)定性不影響使用，長期（3個月以上）其穩(wěn)定性不好。

目前我國許多用于重大動物疫病的檢測制品，由于缺少標準的檢驗用菌毒種和質(zhì)控標準物質(zhì)，導致同一類產(chǎn)品的質(zhì)量存在差異。開展和制備重大動物疫病病原及相關(guān)制品標準物質(zhì)，對我國建立和完善標準菌毒種及檢驗評價用標準物質(zhì)，確保重大動物疫病診斷制品的質(zhì)量均一、安全有效具有重大意義，為我國防控重大動物疫病，保障我國畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，維護我國的食品安全和人民健康提供了有力的保障。

[1]Dickinson A G，Stamp JT.Experimental scrapie in cheviot and suffolk sheep[J].J Comp Path，1969，79（1）:23-26.

[2]馬貴平，李冰玲，田海燕，等.免疫細胞化學法檢測牛腦組織中的BSE病原[J].檢驗檢疫科學，2005，15（15）:32-33.

[3]馬貴平，張寶云，李冰玲，等.瘋牛病感染因子的檢測 [J].畜牧獸醫(yī)學報，2003，34（4）:394-397.

[4]李運敏，田波，張寶云，等.免疫印跡法檢測牛海綿狀腦病和羊瘙癢病[J].生物工程學報，2001，17（5）:494-497.

[5]Steele PJ，Taylor D M，F(xiàn)ernie K.Survival of BSEand scrapie agentsat 200℃[C]//Abstracts of a Meeting of the Association of Veterinary Teachers and Research Workers.Scarborough:England,1999:21.

[6]Brown P，Liberski PP，Wolff A,et al.Resistance of scrapie agent to stream autoclaving after formaldehyde fixation and limitedsurvival after ashing at 360℃[J].JInfec Dis，1990，161:467-472.

[7]韓永志.標準物質(zhì)手冊[M].北京:中國計量出版社，1998.

[8]ISO Guide 30 Terms and Definitions Used in Connection with Reference Materials[S].Switzerland:ISO，1992.