李紅梅 付軍樺 修元德 周清華

胸腔積液可由多種良惡性疾病引起，性質(zhì)不同，治療方案及預(yù)后均不同。目前，常用于胸腔積液鑒別診斷的有胸水常規(guī)、生化、細(xì)胞學(xué)及癌胚抗原等方法，但其靈敏性、特異性及準(zhǔn)確性均較低。胸膜活檢和胸腔鏡等檢查的準(zhǔn)確性高，但創(chuàng)傷大、價(jià)格高。臨床上仍有20%-30%的患者在使用常規(guī)方法仍不能明確胸腔積液的性質(zhì)。近年研究[1,2]表明，端粒酶和細(xì)胞角蛋白19片段（CYFRA 21-1）在惡性胸腔積液中呈陽(yáng)性表達(dá)，可用于惡性胸腔積液的鑒別診斷。

本文采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增-酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法（TRAP-PCR-ELISA）和酶免疫分析法（EIA）分別測(cè)定了80例惡性胸腔積液和50例良性胸腔積液患者胸水中端粒酶活性和CYFRA21-1水平，探討聯(lián)合檢測(cè)此兩項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物在良惡性胸腔積液中的鑒別診斷價(jià)值，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 選擇青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2007年1月-2008年12月收治的130例胸腔積液患者，其中肺癌伴胸腔積液患者80例，男50例，女30例，年齡49歲-76歲，平均年齡59.5歲。均有確切的病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷依據(jù)，其中鱗癌39例，腺癌21例，小細(xì)胞癌15例，大細(xì)胞癌5例。良性胸腔積液患者50例，男32例，女18例，年齡47歲-73歲，平均年齡57.5歲，患者均依據(jù)臨床表現(xiàn)、結(jié)核菌素試驗(yàn)、胸水常規(guī)生化、細(xì)菌培養(yǎng)等檢查確診，其中結(jié)核性胸膜炎25例，肺炎18例，支氣管擴(kuò)張5例，肺膿腫2例。

1.2 端粒酶活性測(cè)定 常規(guī)行胸腔穿刺術(shù)抽取新鮮胸水100 mL送檢，離心（4oC, 1 200 r/min, 10 min），棄上清，離心細(xì)胞置液氮中保存（-196oC）。檢測(cè)前用預(yù)冷的PBS緩沖液（pH7.4）漂洗細(xì)胞2次，分別離心（4oC, 1 200 r/min, 10 min），棄上清。加預(yù)冷的端粒酶裂解緩沖液，0oC 孵化30 min，離心（4oC, 12 000 r/min, 20 min），吸出上清液，取少許測(cè)定蛋白濃度，將細(xì)胞提取物稀釋至3 μg/μL。采用TRAP-ELISA法，將上述各種標(biāo)本的沉淀細(xì)胞（約105-106）置于1.5 mL離心管，150 μL裂解液抽提端粒酶。端粒酶活性和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)：5×端粒重復(fù)擴(kuò)增反應(yīng)混合液，10 μL；TaqDNA多聚酶（5 U/μL），0.4 μL；再加2 μL樣品提取液；37.6 μL蒸餾水。采用PCR擴(kuò)增儀，酶反應(yīng)：30oC、30 min。PCR循環(huán)擴(kuò)增：94oC、30 s，55oC、30 s，35個(gè)循環(huán)。陰性對(duì)照加2 μL裂解液；陽(yáng)性對(duì)照加1 μL端粒酶質(zhì)控模板溶液。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)包被好的微量96孔板捕獲后，加人辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗二硝基苯抗體（Anti-DNP）孵育1 h后洗滌，四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色10 min。MK3酶標(biāo)儀（Dragon Lab System公司）上用雙波長(zhǎng)法測(cè)定各孔波長(zhǎng)450 nm吸光度（A450）、波長(zhǎng)690 nm吸光度（A690）的值，A690為參考波長(zhǎng)，用于消除孔間誤差。端粒酶活性為△A=A450-A690?！鰽大于陰性對(duì)照孔的2.0倍即判定為端粒酶陽(yáng)性。敏感性=惡性胸水患者中陽(yáng)性例數(shù)/惡性胸水患者總數(shù)；特異性=良性胸水患者中陰性例數(shù)/良性胸水患者總數(shù)；準(zhǔn)確性=（惡性胸水患者中陽(yáng)性例數(shù)+良性胸水患者中陰性例數(shù)）/患者總數(shù)。

1.3 CYFRA21-1測(cè)定 取胸腔積液5 mL采用酶免疫分析法（EIA）測(cè)定CYFRA21-1。試劑盒由德國(guó)Boehringer Mannheim公司提供。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為 CYFRA21-1＞10 ng/mL，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算敏感性、特異性和準(zhǔn)確性，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。計(jì)量資料以Mean±SD表示，樣本均數(shù)采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 良惡性胸腔積液端粒酶活性和CYFRA21-1水平檢測(cè)結(jié)果 在80例肺癌致惡性胸腔積液中，有35例發(fā)現(xiàn)了惡性腫瘤細(xì)胞，端粒酶活性為0.395±0.157，其余45例未找到惡性腫瘤細(xì)胞，端粒酶活性為0.347±0.108。良惡性胸腔積液端粒酶活性和CYFRA21-1水平檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，惡性胸腔積液組端粒酶活性和CYFRA21-1水平均明顯高于良性胸腔積液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

表 1 良惡性胸腔積液端粒酶活性和CYFRA21-1水平的表達(dá)（Mean±SD）Tab 1 The expression of telomerase activity and CYFRA21-1 level in benign and malignant pleural effusion (Mean±SD)

2.2 端粒酶和CYFRA21-1單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)惡性胸腔積液的診斷價(jià)值 由表2可見(jiàn)，兩項(xiàng)腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測(cè)若以一項(xiàng)陽(yáng)性作為惡性胸腔積液的診斷標(biāo)準(zhǔn)，則聯(lián)合檢測(cè)敏感性為90.0%，明顯高于端粒酶和CYFRA21-1單項(xiàng)檢測(cè)的敏感性71.3%和60.0%（χ2=9.002和χ2=19.201，P＜0.01和P＜0.001），特異性雖下降為76%，但準(zhǔn)確性升高為86.9%，準(zhǔn)確性差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.389和χ2=14.647，P＜0.05和P＜0.001）。

3 討論

表 2 端粒酶和CYFRA21-1檢測(cè)對(duì)惡性胸腔積液的診斷價(jià)值Tab 2 The diagnotic value of telomerase and CYFRA21-1 in malignant pleural effusion

端粒是真核生物染色體末端包含著獨(dú)特重復(fù)片段的特殊結(jié)構(gòu)，它能催化染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)端粒復(fù)制，它存在于人的生殖細(xì)胞、永生化細(xì)胞系、腫瘤細(xì)胞和增殖組織。惡性腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要生物學(xué)特征是永生化，這與端粒酶激活有關(guān)。且端粒酶活性的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展都有相關(guān)性[3,4]。研究[5]表明，大多數(shù)腫瘤組織細(xì)胞均有較高水平的端粒酶表達(dá)，而在正常組織和體細(xì)胞為陰性，因此可作為癌癥篩選的標(biāo)記物。腫瘤的胸膜轉(zhuǎn)移和胸膜原發(fā)腫瘤等引起的胸腔積液與炎性胸腔積液，其端粒酶活性的差異可用于鑒別良惡性胸腔積液。文獻(xiàn)[6]報(bào)道肺癌組織中端粒酶陽(yáng)性率達(dá)80%，惡性胸液中端粒酶陽(yáng)性率約為47.5%-91.4%。

CYFRA21-l是細(xì)胞角蛋白19片段，由多種上皮細(xì)胞表達(dá)，是一種分子量為40 ku-68 ku的細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白，主要分布于肺組織尤其是肺腫瘤上皮細(xì)胞漿中，可在激活的蛋白酶作用下被降解或在細(xì)胞死亡后以溶解片段形式釋放入血清中[7]。研究[8]表明：惡性胸腔積液患者血和胸水中CYFRA21-1水平均明顯增高，且以胸水中升高明顯，其對(duì)惡性胸腔積液診斷敏感性約50%-77%，特異性約60%-79%。

本研究選擇80例惡性胸腔積液患者和50例良性胸腔積液患者，分別檢測(cè)其胸水中端粒酶活性和CYFRA21-1水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)惡性胸腔積液患者端粒酶活性明顯高于良性胸腔積液患者，CYFRA21-1水平亦明顯高于良性胸腔積液患者，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[9,10]。故端粒酶和CYFRA21-1均可作為良惡性胸腔積液鑒別診斷的輔助手段。

由于腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)各型癌癥均具有高度特異性和敏感性的標(biāo)志。眾多研究者已達(dá)成共識(shí)，通過(guò)采用聯(lián)合檢測(cè)可提高診斷效能，彌補(bǔ)單項(xiàng)標(biāo)志對(duì)不同組織類(lèi)型腫瘤敏感性不同的缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，端粒酶和CYFRA21-1兩項(xiàng)腫瘤標(biāo)志聯(lián)合測(cè)定若以一項(xiàng)陽(yáng)性作為惡性胸腔積液的診斷標(biāo)準(zhǔn)，則敏感性為90.0%（72/80），特異性為76.0%（38/50），準(zhǔn)確性為86.9%（113/130）；若以?xún)身?xiàng)均陽(yáng)性作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，敏感性下降至56.3%（45/80），特異性可達(dá)94.0%（47/50），準(zhǔn)確性下降至70.8%（92/130）。因此，臨床如有一項(xiàng)陽(yáng)性，要考慮惡性胸腔積液的診斷，并作進(jìn)一步檢查；如兩項(xiàng)同時(shí)陽(yáng)性則診斷為惡性胸腔積液的特異性高。上述結(jié)果表明聯(lián)合測(cè)定胸腔積液中端粒酶和CYFRA21-1水平，可提高惡性胸腔積液的診斷率，尤其對(duì)良性和惡性胸腔積液的鑒別診斷具有重要的意義。