管燕 郭其森 曾洪生

肺癌已成為我國惡性腫瘤死亡率之首，其中占肺癌80%的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是導(dǎo)致肺癌高發(fā)病率和高死亡率的主要原因。血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C）是一種針對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，具有刺激血管和淋巴管生成的雙重作用，其表達(dá)與腫瘤的血管生成、臨床病理特征和不良預(yù)后有關(guān)[1]。表皮生長因子受體 ( epidermal growth factor receptor, EGFR）是原癌基因CerbB-1的表達(dá)產(chǎn)物，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年來對EGFR與腫瘤的血管生成、高侵襲性及轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究越來越多，很多研究[2,3]提示EGFR的高表達(dá)往往反映腫瘤的高侵襲力、高轉(zhuǎn)移性及預(yù)后不良。本實驗利用RT-PCR與熒光定量PCR技術(shù)檢測NSCLC患者和良性肺病患者的腫瘤組織及淋巴結(jié)組織中VEGF-C mRNA和EGFR mRNA的表達(dá)水平并分析其相關(guān)性，以探討兩因子表達(dá)水平與臨床病理因素之間的相關(guān)性及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 總RNA抽提試劑盒購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，電泳系統(tǒng)購自BIO-RAD公司，熒光定量基因擴(kuò)增儀7000型購自美國ABI公司。逆轉(zhuǎn)錄引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，VEGF-C基因：Forward primer：5'-TCAAGGACAGAAGAGACTATAAAATTTGC-3'；Reverse primer：5'-ACTCCAAACTCCヰCCCCACAT-3'。EGFR基因：Forward primer：5'-GGACTCTGGATCCCAGAAGGTG-3'；Reverse primer：5'-GCTGGCCATCACGTAGGCTT-3'。GAPDH基因：Forward primer：5'- CAACAGCCTCAAGATCATCAGC-3'；Reverse primer：5'- ヰCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3'。

1.2 標(biāo)本來源 選取2008年1月-2009年10月在山東省腫瘤醫(yī)院胸外科行手術(shù)切除的NSCLC患者56例為病例組，良性肺病患者10例為對照組。病例組患者平均年齡59.98歲（36歲-37歲），腺癌26例，鱗癌24例，其它6例，高分化9例，中分化28例，低分化19例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，I期13例，II期17例，III期23例，IV期3例。對照組患者平均年齡52.61歲（34歲-67歲），肺錯構(gòu)瘤2例，肺炎性假瘤4例，肺結(jié)核4例。病例組采集術(shù)中切除的新鮮腫瘤組織和淋巴結(jié)組織，對照組采集病灶組織。手術(shù)結(jié)束編號標(biāo)記后立即凍存于-80oC冰箱中備用。

1.3 方法 采用TRIzol法從組織中提取總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA質(zhì)量和純度；逆轉(zhuǎn)錄總RNA得到cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增出目的片段VEGF-C、EGFR和GAPDH；使用Geneamp Pcr System 9600型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，用TAE配制1.5%的瓊脂糖凝膠，在110 V電壓下擴(kuò)增40 min，進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳鑒定；用標(biāo)準(zhǔn)品DNA對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，取2 μL PCR產(chǎn)物加入18 μL ddH2O，取2 μL稀釋后的PCR產(chǎn)物加入18 μL SYBR，引物各0.5 μL，cDNA 2.5 μL，用不含RNA酶的水補(bǔ)至25 μL，短暫離心后進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95oC、10 s，然后以95oC 5 s，57oC 20 s，72oC 30 s循環(huán)40次，60oC、15 min后檢測信號；根據(jù)分子量計算出將1 μL樣品濃度調(diào)整為1×109個拷貝/mL所需加入ddH2O的量；分別加入相應(yīng)體積液體將樣品稀釋成1×109個拷貝/mL，梯度稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的CT值可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出各個樣品的濃度（拷貝數(shù)/mL），管家基因的表達(dá)相對恒定，計算出目的基因的拷貝數(shù)與相同樣本的管家基因的拷貝數(shù)的比值作為目的基因的表達(dá)水平，從而得到計量資料。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。所有計量資料均應(yīng)先經(jīng)過單樣本K-S檢驗，判斷是否為正態(tài)分布。符合雙樣本均為正態(tài)分布的計量資料比較采用t檢驗、直線相關(guān)分析等方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測VEGF-C和EGFR在腫瘤組織和淋巴結(jié)組織中的表達(dá)情況 以cDNA為模板，分別以VEGF-C、EGFR和GAPDH引物行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出目的片段VEGF-C、EGFR和GAPDH，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

2.2 熒光定量PCR檢測結(jié)果 目的基因VEGF-C、EGFR與管家基因的溶解曲線（圖2）的定量結(jié)果顯示，VEGF-C mRNA在肺癌組患者腫瘤組織及淋巴結(jié)組織中的表達(dá)水平高于良性肺病組（59.6±12.5 vs 42.8±8.5, P＜0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（62.3±15.3 vs 48.2±12.6, P=0.001），肺癌組織中與淋巴結(jié)組織中VEGF-C mRNA表達(dá)水平呈同向變化，直線相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)VEGF-C在腫瘤組織中的表達(dá)水平與淋巴結(jié)組織中的表達(dá)水平明顯相關(guān)（r=0.834, P＜0.001）（圖3A）。EGFR mRNA在肺癌組患者腫瘤組織中的表達(dá)水平高于良性肺病組（6.27±0.96 vs 5.37±0.48, P=0.015），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（6.19±0.90 vs 5.15±0.86, P=0.012），直線相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)EGFR在腫瘤組織中的表達(dá)水平與淋巴結(jié)組織中的表達(dá)水平明顯相關(guān)（r=0.817, P＜0.001）（圖3B）。

圖 1 VEGF-C和EGFR在腫瘤組織（A）和淋巴結(jié)組織（B）中的表達(dá)。1：GAPDH；2：VEGF-C；3：EGFR；4：DNA marker。Fig 1 Expressions of VEGF-C (A) and EGFR (B) in tumor tissues and lymph node tissues. 1： GAPDH； 2： VEGF-C； 3： EGFR； 4： DNA marker.

圖 2 VEGF-C（A）和EGFR（B）的溶解曲線Fig 2 Dissolving curve of VEGF-C (A) and EGFR (B)

圖 3 VEGF-C（A）和EGFR（B）在腫瘤組織與淋巴結(jié)組織中表達(dá)的相關(guān)性Fig 3 VEGF-C (A) and EGFR (B) expressions in tumor tissues and lymph node tissues

3 討論

腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)是一個多因子參與的復(fù)雜過程，新生血管和淋巴管的生成在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。一些分子標(biāo)志物的檢測可以指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后，進(jìn)而使患者獲益更大。VEGF家族是高度特異的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，可特異性促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長及血管生成，增加血管的通透性，有助于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，是目前誘導(dǎo)腫瘤血管生成作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生長因子[4]。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞本身、腫瘤浸潤的巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞能分泌高水平VEGF。VEGF-C由7個外顯子組成，是一種針對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，具有刺激血管和淋巴管生成的雙重作用。多項研究提示，人類腫瘤表達(dá)的VEGF-C與腫瘤的轉(zhuǎn)移播散相關(guān)，且腫瘤進(jìn)展過程與淋巴管生成有關(guān)，淋巴管生成已成為目前腫瘤轉(zhuǎn)移研究的熱點(diǎn)。Zhang等[5]應(yīng)用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)研究VEGF-C在人乳腺癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示VEGF-C mRNA表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，并認(rèn)為 VEGF-C表達(dá)是臨床評價乳腺癌淋巴侵襲擴(kuò)散的指標(biāo)之一。Mylona[6]研究了乳腺癌中VEGF-C蛋白表達(dá)與淋巴管、血管侵犯與腫瘤增殖的關(guān)系，結(jié)果顯示VEGF-C的表達(dá)更多的是通過脈管容量的增加而不單是通過淋巴管數(shù)量的增加來發(fā)揮作用。Li[7]利用RT-PCR、免疫組化方法檢測了VEGF-C在52例NSCLC患者手術(shù)切取的腫瘤組織和淋巴結(jié)組織中的表達(dá)，結(jié)果表明VEGF-C mRNA、VEGF-C蛋白表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為預(yù)測NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)指標(biāo)。

本研究選擇新鮮的冰凍腫瘤組織和淋巴結(jié)組織進(jìn)行VEGF-C和EGFR表達(dá)研究，新鮮冰凍組織與石蠟包埋的組織相比為更好的研究對象，研究結(jié)果更可靠[8]。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，本研究引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光信號強(qiáng)度，這樣我們就能通過熒光信號強(qiáng)度的變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化。表示每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為CT值。我們通過獲得未知樣品的CT值，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品的拷貝數(shù)。本研究分析了VEGF-C與臨床病理特點(diǎn)的聯(lián)系，表明VEGF-C無論是在腫瘤組織中還是淋巴結(jié)組織中的表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，VEGF-C可以作為NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標(biāo)。腫瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF-C的過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤內(nèi)淋巴管的生成，從而促進(jìn)區(qū)域淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。我們對腫瘤組織和淋巴結(jié)組織中VEGF-C表達(dá)的分析表明：VEGF-C mRNA的表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.001）。NSCLC患者與良性肺部疾病患者腫瘤組織中與淋巴結(jié)組織中EGFR mRNA的表達(dá)均有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.001）。VEGF-C無論是在腫瘤組織中還是淋巴結(jié)組織中的表達(dá)，均與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。目前癌細(xì)胞經(jīng)淋巴道播散的機(jī)制尚不明了，但VEGF-C與淋巴管形成的相關(guān)性是明確的，其導(dǎo)致轉(zhuǎn)移增高的原因可能包括：①VEGF-C與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的VEGFR-3結(jié)合，誘導(dǎo)VEGFR-3酪氨酸激酶磷酸化，增加瘤內(nèi)、瘤周淋巴管的數(shù)目和管徑，提升了腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)會[9]；②VEGF-C可使血管、淋巴管的滲透性增加，可能是通過VEGFR-2和VEGFR-3介導(dǎo)實現(xiàn)的[10]；③VEGF-C通過改變腫瘤細(xì)胞與胞外基質(zhì)的粘附性，提高癌細(xì)胞的粘附作用；④VEGF-C可作為一種趨化因子，這可能與其特殊的蛋白溶解酶作用有關(guān)，一方面增強(qiáng)腫瘤和特異器官的親和性，另一方面促進(jìn)癌細(xì)胞向淋巴管方向移動，實現(xiàn)轉(zhuǎn)移。總之，VEGF-C參與人NSCLC的浸潤、轉(zhuǎn)移，但關(guān)于VEGF-C在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制及與預(yù)后的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

EGFR是一種具有酪氨酸激酶活性的膜表面?zhèn)鞲衅鳎毡楸磉_(dá)于人體的表皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，并在多種人類惡性腫瘤中高表達(dá)，其所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)具有多向性，包括增殖、遷移、細(xì)胞分化和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等，與細(xì)胞的再生和惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Pore等[11]研究表明，在晚期漿液性低分化卵巢癌中EGFR過度表達(dá)和腫瘤血管發(fā)生有關(guān)，腫瘤細(xì)胞有血液供應(yīng)增殖更加迅速。Fresno等[12]使用RT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示EGFR在NSCLC組織中高表達(dá)，EGFR在NSCLC組織中的表達(dá)率明顯高于良性腫瘤和正常組織（P＜0.05），表明EGFR在肺腫瘤發(fā)生過程中可能起到了一定的作用。Tomov等[13]采用免疫組化方法研究了EGFR在良、惡性卵巢腫瘤中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)惡性卵巢組織EGFR的表達(dá)率明顯高于良性組織，差別有統(tǒng)計學(xué)意義；有腹水和進(jìn)展期患者的EGFR表達(dá)率更高，研究表明卵巢癌細(xì)胞中EGFR的過度表達(dá)導(dǎo)致侵襲力增加。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤組織及淋巴結(jié)組織中EGFR mRNA的表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組有統(tǒng)計學(xué)差異，是EGFR表達(dá)與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)的直接證據(jù)，表明 EGFR參與了NSCLC的發(fā)展過程，所以，EGFR高表達(dá)往往反映了腫瘤的高侵襲力、高轉(zhuǎn)移性及預(yù)后不良，EGFR可以作為肺癌早期診斷轉(zhuǎn)移或微轉(zhuǎn)移，判斷預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。本研究還表明NSCLC患者與良性肺部疾病患者的腫瘤組織與淋巴結(jié)組織中EGFR mRNA的表達(dá)水平均有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.015, P=0.020），但是目前關(guān)于肺癌患者與良性肺病兩組之間差異的報道還存在一定的矛盾[14]。

本研究中腫瘤組織和淋巴結(jié)組織中VEGF-C mRNA的表達(dá)經(jīng)直線相關(guān)分析具有相關(guān)性，且腫瘤組織和淋巴結(jié)組織中EGFR mRNA的表達(dá)經(jīng)直線相關(guān)分析亦具有相關(guān)性，提示VEGF-C和EGFR可能具有相似的生物學(xué)標(biāo)記的意義，這將為采用淋巴結(jié)組織替代腫瘤組織檢測VEGF-C和EGFR提供了理論依據(jù)，有可能為患者提供一種更快捷、簡便的替代檢測方法，有助于減輕患者痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并對肺癌的早期診斷轉(zhuǎn)移或微轉(zhuǎn)移、評價預(yù)后及多靶點(diǎn)個體化治療的選擇奠定了理論基礎(chǔ)。