張瑩 李敏 劉宇 韓迺珺 張開泰 肖汀 程書鈞 高燕寧

在世界范圍內，肺癌已經成為嚴重威脅人類生存健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率位列腫瘤首位[1]。中國國家衛(wèi)生部公布的資料[2]顯示，肺癌已替代肝癌成為我國首位惡性腫瘤死亡原因，占全部惡性腫瘤死亡的22.7%。腫瘤相關蛋白標志物是重要的輔助診斷、判斷預后和指導治療的生物學指標。目前，臨床常規(guī)使用的肺癌相關血清學蛋白標志物主要包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、糖蛋白抗原125（carbohydrate antigen 125, CA125）、鱗狀細胞癌相關抗原（squamous cell carcinoma antigen, SCC Ag）、細胞角蛋白19血清片段21-1（cytokeratin fragment antigen 21-1,CYFRA21-1）和神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE），但其敏感性和特異性不高。

烯醇化酶1（alpha-enolase, ENO1）與NSE同屬于烯醇化酶家族，位于細胞質，是糖酵解途徑重要的代謝酶。近年來的研究[3]表明ENO1的細胞定位和生物學功能具有多樣性，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，如定位于細胞膜的ENO1可促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[4]，定位于細胞質的ENO1可促進腫瘤細胞的生長和運動[4]，定位于細胞核的ENO1可抑制腫瘤細胞的生長[5]。Li和Chang等[6,7]發(fā)現ENO1作為肺癌相關抗原，在肺癌細胞中高表達，并且其高表達提示臨床預后差[7]。目前，尚未見報道ENO1在腫瘤患者外周血中的檢測情況。

我們實驗室利用新型的蛋白質組研究體系建立了一個肺癌相關分泌/釋放蛋白數據庫[8]，其中包括ENO1；從而我們推測ENO1有可能出現在肺癌患者外周血中。以上述發(fā)現為基礎，在本項研究中我們分別采用Western blot方法和雙抗體夾心酶聯免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）檢測非小細胞肺癌患者腫瘤組織和血漿中ENO1蛋白的水平，并初步探討ENO1作為肺癌相關蛋白標志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 所有臨床樣品取自1999年12月-2005年9月中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院胸部腫瘤外科收治的患者。根據世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）2004年肺癌組織學分型標準進行肺癌組織學分型，根據國際抗癌聯盟 （International Union Against Cancer, UICC）2002年發(fā)布的第6版肺癌TNM分期系統(tǒng)進行肺癌分期。

1.1.1 組織樣品 組織樣品取自接受手術治療的16例男性肺鱗癌（squamous cell carcinoma, SCC）患者，中位年齡65歲（44歲-76歲）；其中I期4例，II期3例，III期7例，IV期1例，無明確分期1例。所有患者術前均未接受過放療或化療。手術后收集切除的腫瘤組織及其配對的遠端正常肺組織，-80oC保存。

1.1.2 血漿樣品 用于ELISA的血漿樣品共160例，分別取自42例健康體檢者，中位年齡52歲（40歲-65歲），男性30例，女性12例；34例肺部良性疾病患者，中位年齡51歲（14歲-70歲），男性23例，女性11例；84例非小細胞肺癌患者，中位年齡60歲（37歲-76歲），男性60例，女性24例；包括32例肺鱗癌和52例肺腺癌（adenocarcinoma,ADC），其中I期31例，II期26例，III期22例，IV期5例。所有患者在采血前均未接受過放療或化療。

1.2 方法

1.2.1 組織蛋白抽提和保存 取適當大小的組織塊，加入300 L細胞裂解液（包含RIPA裂解緩沖液、蛋白酶抑制劑cocktail和PSMF），置于冰上裂解30 min，其間在渦旋器上進行充分混合；然后以12 000 rpm于4oC離心20 min，收集上清液，采用BCA Protein Assay Kit（Pierce, IL, USA）進行蛋白定量；分裝后于-80oC保存。

1.2.2 血漿的收集和保存 用EDTA抗凝管采集4 mL靜脈血，于4oC離心，1 000 g、10 min，收集血漿，分裝后于-80oC保存。

1.3 Western blot檢測組織樣品中ENO1蛋白水平 采用10%SDS-PAGE分離膠電泳分離變性后的60 g組織蛋白，隨后使用半干式電轉儀將分離后的蛋白轉移至硝酸纖維素膜，電轉后的膜在5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h。將轉有組織蛋白的膜在鼠抗人ENO1單克隆抗體（1:1 000稀釋，Edward F. Plow教授惠贈）溶液中4oC孵育過夜，然后在帶辣根過氧化物酶標簽的羊抗鼠二抗溶液（1:4 000稀釋，Jackson ImmunoResearch，PA，USA）中室溫孵育1 h。最后采用Western Blotting Luminol Reagent（Santa Cruz Biotechnology, CA, USA）發(fā)光試劑盒檢測，X線膠片曝光、顯影、定影。以β-actin作為內參蛋白，使用β-actin鼠單抗（1:3 000, Sigma-Aldrich, MO, USA）作為一抗。

1.4 雙抗體夾心ELISA測定血漿中ENO1蛋白水平 以上述ENO1鼠單抗（1:100稀釋，Edward F. Plow教授惠贈）為捕獲抗體，包被96孔板，4oC過夜后，以2%BSA封閉96孔板4 h，之后每孔加入50 L待測血漿孵育1 h。以ENO1兔抗人ENO1多克隆抗體（1:4 000稀釋，AVIVA Systems Biology，San Diego，CA）為檢測抗體，孵育1 h。然后加入帶辣根過氧化物酶標簽的羊抗兔二抗溶液（1:4 000稀釋，Jackson ImmunoResearch，PA，USA），孵育30 min。加入顯色液，避光反應30 min，最后由酶標儀（Bio-Rad Laboratory, CA, USA）于450 nm/570 nm雙波長設定下讀取光密度（optical density, OD）值。由于目前沒有商業(yè)化的ENO1標準蛋白，故采用肺癌細胞系A549的總蛋白用1×PBS梯度稀釋，稀釋比依次為1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640，以此繪制標準曲線，進行板間差校正。

1.5 實驗數據的統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.5軟件（SPSS INC, IL, USA）進行統(tǒng)計學分析。利用非參數檢驗中的Mann-Whitney Test比較兩組人群血漿ENO1蛋白水平。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ENO1蛋白在肺鱗癌組織中的表達 ENO1蛋白在16例肺鱗癌患者的腫瘤組織及其配對正常肺組織中的表達情況如圖1所示，14例肺鱗癌患者腫瘤組織中ENO1的蛋白表達量高于其配對正常肺組織（除了17號患者和18號患者），高表達率為87.5%。

2.2 ENO1蛋白在不同人群血漿中的水平 采用雙抗體夾心ELISA方法檢測ENO1蛋白在三組人群（即健康體檢者、肺部良性疾病患者和非小細胞肺癌患者）血漿中的水平。結果如表1和圖2，非小細胞肺癌患者血漿中ENO1蛋白水平顯著高于健康體檢者（P=0.031）和肺部良性疾患者（P=0.019）。血漿中ENO1蛋白水平在肺部良性疾病患者和健康體檢者之間沒有明顯差異（P=0.904）。肺腺癌患者血漿中ENO1蛋白水平明顯高于肺鱗癌患者（P=0.023）。

3 討論

糖酵解途徑是機體獲取能量的一種方式，在供氧不足的生理狀態(tài)下，它為機體提供能量。腫瘤細胞普遍存在糖酵解途徑的增強[9-11]，Altenberg等[12]綜合分析了腫瘤的糖酵解通路中代謝酶相關基因的表達情況，發(fā)現在24種腫瘤中糖酵解通路增強，肺癌是其中之一。糖酵解通路中涉及10個代謝酶，其中丙酮酸激酶（pyruvate kinase,PK）是糖酵解通路中的限速酶，其亞型PKM2除了發(fā)揮催化能量代謝的作用，還具有與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的生物學功能[13,14]，并且腫瘤患者血漿中PKM2的水平顯著升高[15-17]，提示其可能作為血漿診斷標志物。因此，糖酵解通路中其它代謝酶可能也與腫瘤有著緊密的聯系。

烯醇化酶是糖酵解途徑中的代謝酶，該家族包含三個成員，分別是ENO1、ENO2和NSE。NSE作為肺癌相關血清學蛋白標志物，已被用于臨床上指導小細胞肺癌患者的療效監(jiān)測、復發(fā)預測和預后評估。我們實驗室前期建立的肺癌相關分泌/釋放蛋白數據庫中包含與NSE同家族的ENO1[8]，作為肺癌相關抗原[6,7]，ENO1極可能是潛在的肺癌標志物。本研究結果顯示，ENO1蛋白在肺鱗癌患者腫瘤組織中的表達高于其配對正常肺組織，此結果與其它針對臨床腫瘤樣本的研究結果基本一致[6,7,18]，盡管與Chang等[19]的發(fā)現相反。

ENO1位于細胞質，它可能通過腫瘤細胞壞死和細胞更新（cell turnover）或者非經典的分泌途徑被釋放到細胞外[20,21]，從而進入外周血。如糖酵解途徑中大多數的代謝酶，包括ENO1，均可借助外來體途徑（exosome pathway）被分泌到細胞外[21]。結果顯示，較之健康人群和肺部良性疾病人群，非小細胞肺癌患者血漿中ENO1蛋白水平明顯升高，因此ENO1可能作為肺癌相關血漿蛋白標志物。同時需要指出的是，因為目前尚無商業(yè)化的ENO1標準蛋白，所以我們無法繪制標準曲線來獲得具體的蛋白濃度值。盡管ENO1可通過特定途徑進入外周血，但其在外周血中的濃度很低，采用自行構建的雙夾心ELISA體系檢測的信號值偏低（OD值＜0.1）。不過，鑒于A549細胞內的ENO1蛋白的OD值最大值僅在0.3左右，所得血漿ENO1蛋白OD值亦為合理范圍。由于目前尚未見采用ELISA方法檢測外周血血漿中ENO1蛋白的報道，我們自行建立的ENO1蛋白ELISA檢測體系及其實驗結果具有一定的意義和參考價值。

表 1 健康體檢者、肺部良性疾患者、非小細胞肺癌患者三組人群血漿中ENO1蛋白水平Tab 1 Levels of ENO1 protein in the plasma of non-small cell lung cancer patients and the controls

圖 1 ENO1在肺鱗癌患者的腫瘤組織（T）及其配對正常肺組織（N）中的表達情況。β-actin作為內參蛋白。Fig 1 ENO1 protein expression in tumor tissues and corresponding normal tissues from 16 cases of lung squamous cell carcinoma. β-actin served as an internal control of protein loading.

圖 2 肺癌及其對照組人群血漿中ENO1蛋白水平。水平線代表ENO1蛋白水平的中位值。Fig 2 Scatter plots of ENO1 protein levels in NSCLC cohort(cancer), benign disease cohort (benign) healthy women cohort(healthy), lung squamous cell carcinoma (SCC) cohort and lung adenocarcinoma (ADC) cohort. Median levels of ENO1 protein levels are represented by horizontal lines.

ENO1對腫瘤進展具有雙向作用，如定位于細胞膜的ENO1可促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[4]，定位于細胞質的ENO1可促進腫瘤細胞的生長和運動[4]，定位于細胞核的ENO1可抑制腫瘤細胞的生長[5]。但我們結果提示ENO1可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中更多地發(fā)揮著促進的作用。另外，我們還發(fā)現非小細胞肺癌患者血漿中ENO1蛋白水平與肺癌的組織病理類型相關，即肺腺癌患者血漿中ENO1蛋白水平顯著高于肺鱗癌患者，推測ENO1作為潛在的肺腺癌血漿蛋白標志物可能更具有臨床應用價值；因而有必要繼續(xù)深入研究。

致謝

本研究構建的ENO1雙抗體夾心ELISA體系中的鼠抗人ENO1單克隆抗體由Edward F. Plow教授（Cleveland Clinic, Ohio, USA）惠贈，特致謝意。