王 宇，肖景瑩，王春仁*，高俊峰，朱興全

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯， 154007；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州， 510642）

基于線粒體nad4基因探討土耳其斯坦東畢吸蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)生位置

王 宇1，肖景瑩2，王春仁1*，高俊峰1，朱興全3

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯， 154007；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州， 510642）

為探討土耳其斯坦東畢吸蟲(chóng)在血吸蟲(chóng)中的系統(tǒng)發(fā)生位置，本研究設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過(guò)PCR方法對(duì)土耳其斯坦東畢吸蟲(chóng)(綿羊源）線粒體煙酰胺脫氫酶亞基Ⅳ基因(nad4）進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序分析，并與GenBank中相關(guān)血吸蟲(chóng)nad4基因進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，本研究克隆的該吸蟲(chóng)線粒體nad4基因序列大小約為1 030 bp，與已發(fā)表的其它血吸蟲(chóng)線粒體nad4基因的同源性為51.6%～66.7%，其系統(tǒng)發(fā)生位置屬于非洲血吸蟲(chóng)種群。

土耳其斯坦東畢吸蟲(chóng)；線粒體DNA；煙酰胺脫氫酶亞基Ⅳ基因；系統(tǒng)發(fā)生

土耳其斯坦東畢吸蟲(chóng)(Orientobilharzia turkestanicum）是寄生于牛、羊等多種動(dòng)物門(mén)靜脈和腸系膜靜脈的一種血吸蟲(chóng)，引起動(dòng)物的東畢吸蟲(chóng)病，該蟲(chóng)的尾蚴還可感染人，引起人的尾蚴性皮炎[1]。土耳其斯坦東畢吸蟲(chóng)病主要分布于亞洲和歐洲的一些地區(qū)，常呈地方性流行，對(duì)畜牧業(yè)危害嚴(yán)重，該病為黑龍江省重要的吸蟲(chóng)病之一[2]。

關(guān)于O.turkestanicum的分類地位，我們?cè)群罄镁€粒體cox1和nad1基因和核糖體ITS和28SrDNA-LSU序列進(jìn)行了一些研究工作，并推斷O.turkestanicum隸屬于非洲血吸蟲(chóng)種群[3-4]。然而，在遺傳標(biāo)記基因中，線粒體DNA(mtDNA）中的煙酰胺脫氫酶亞基Ⅳ基因(nad4）是一個(gè)進(jìn)化率較高的基因，利用它作遺傳標(biāo)記對(duì)寄生蟲(chóng)進(jìn)行群體遺傳和分類研究具有重要意義[5-7]。因此本研究以nad4基因作為標(biāo)記基因，進(jìn)一步探討O.turkestanicum在系統(tǒng)中的分類地位。

1 材料和方法

1.1 蟲(chóng)體樣品 通過(guò)糞便檢查，選擇黑龍江省大慶市自然感染東畢吸蟲(chóng)的綿羊，剖檢收集蟲(chóng)體，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為O.turkestanicum，蟲(chóng)體保存于70%乙醇中備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 EasyPure Genomic DNA Extraction Kit和EasyPure Plasmid MiniPrep Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；StarPrep Gel Extraction Kit購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；pGEM-T購(gòu)自Promega公司；LATaqDNA聚合酶、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶DNA Marker(DL2000、DL15000）購(gòu)自寶生物工程(大連）有限公司；大腸桿菌(E.coli）感受態(tài)細(xì)胞TG1由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.3 蟲(chóng)體總DNA的提取 將15條土耳其斯坦東畢吸蟲(chóng)成蟲(chóng)置于無(wú)菌的1.5 mL離心管中，用北京全式金生物技術(shù)有限公司DNA抽提試劑盒提取蟲(chóng)體總DNA，提取的DNA樣品置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4nad4基因的擴(kuò)增與純化 根據(jù)GenBank登錄的梭形血吸蟲(chóng)(NC_008067）和埃及血吸蟲(chóng)(NC_008074）nad4基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)一對(duì)用于擴(kuò)增線粒體nad4基因的特異性引物，上游引物為5'-ATGTAT TCGAGTTCCGTTTGG-3'；下游引物為5'-AAAAAC TGAAGAGTTGGTGGAAACC-3'。PCR反應(yīng)體系為25 μL；反應(yīng)條件為：94℃10 min；94℃30 s、49℃30 s、72℃1.5 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)后，進(jìn)行純化。

1.5nad4基因的克隆 將純化nad4基因PCR產(chǎn)物與pGEM-T連接，轉(zhuǎn)化E.coliTG1感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒DNA，然后進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。

1.6nad4基因的測(cè)定與分析 經(jīng)過(guò)鑒定為陽(yáng)性的nad4重組質(zhì)粒由北京英駿生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，利用DNAStar和ClustalX1.83軟件對(duì)nad4基因序列進(jìn)行比對(duì)，分析O.turkestanicum線粒體nad4基因與其他血吸蟲(chóng)的nad4基因的同源性，利用MEGA3.1軟件，以肝片形吸蟲(chóng)(Fasciola hepatica）為外群，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，探討O.turkestanicum在血吸蟲(chóng)分類中的地位。

2 結(jié)果和討論

2.1nad4基因的擴(kuò)增 應(yīng)用特異性引物從分離的O.turkestanicum線粒體基因組DNA擴(kuò)增出約為1 000 bp的nad4基因片段，與預(yù)期目的片段長(zhǎng)度相符(圖1）。將PCR純化產(chǎn)物與pGEM-T載體連接后轉(zhuǎn)化E.coliTG1感受肽細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切鑒定。雙酶切鑒定結(jié)果表明，nad4基因成功克隆至pGEM-T載體的多克隆位點(diǎn)中。

2.2nad4基因的序列分析 經(jīng)DNAStar 6.0軟件分析，O.turkestanicum線粒體nad4基因的同源性和遺傳距離如表1所示。通過(guò)同源性比較及進(jìn)化關(guān)系表明，O.turkestanicum與其它血吸蟲(chóng)線粒體nad4基因的同源性為51.6%～66.7%，與梭形血吸蟲(chóng)最為相近，同源性達(dá)到66.7%。

將O.turkestanicum的nad4基因與曼氏血吸蟲(chóng)、埃及血吸蟲(chóng)、梭形血吸蟲(chóng)、湄公血吸蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)等10種血吸蟲(chóng)比較，其同源性在51.6%～66.7%之間，其中與梭形血吸蟲(chóng)的同源性最高，可見(jiàn)，O.turkestanicum與梭形血吸蟲(chóng)的親緣最近。

以肝片形吸蟲(chóng)nad4基因作為該進(jìn)化樹(shù)的外群，采用NJ法構(gòu)建O.turkestanicum進(jìn)化樹(shù)(圖2）。由血吸蟲(chóng)nad4基因構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)可以看出，血吸蟲(chóng)被分為兩個(gè)群：裂體屬的血吸蟲(chóng)和其它屬的血吸蟲(chóng)，其中O.turkestanicum的發(fā)生位置處于裂體屬血吸蟲(chóng)中，裂體屬血吸蟲(chóng)又被分為兩個(gè)群：非洲血吸蟲(chóng)種群和亞洲血吸蟲(chóng)種群，其中O.turkestanicum的發(fā)生位置處于非洲血吸蟲(chóng)種群中。

與GenBank登錄的其他吸蟲(chóng)的nad4基因的序列進(jìn)行比對(duì)，我們得出結(jié)論，馬來(lái)血吸蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)和湄公血吸蟲(chóng)均屬于亞洲血吸蟲(chóng)種群，而O.turkestanicum與埃及血吸蟲(chóng)、曼氏血吸蟲(chóng)、梭形血吸蟲(chóng)以及羅海因血吸蟲(chóng)均屬于非洲血吸蟲(chóng)種群。這一結(jié)論與Li等和Wang等在對(duì)cox1、nad1、ITS1以及ITS2等基因的分析中所得出的結(jié)論一致[3-4]。

mtDNA為雙鏈閉環(huán)分子，具有獨(dú)立進(jìn)化且速率比核DNA快、基因組精簡(jiǎn)等特點(diǎn)[8]，同時(shí)由于線粒體為母系遺傳，線粒體基因間不發(fā)生重組，所以可以反映出母系的進(jìn)化歷史，這樣線粒體一個(gè)基因就可以代表整個(gè)線粒體基因組的變異情況。線粒體基因在血吸蟲(chóng)分類地位和種系發(fā)生的研究十分可靠，尤其是適合于較近緣的物種之間的研究，但應(yīng)用較多的標(biāo)記基因主要為cox1，應(yīng)用nad4的較少。Blouin等通過(guò)對(duì)毛圓科(Trichostrongylidae）中的4個(gè)種的nad4序列進(jìn)行種間和種內(nèi)比較，分析得出nad4無(wú)論在種間還是在種內(nèi)都具有高度的變異性和多態(tài)性[9]。通過(guò)對(duì)O.turkestanicum的nad4序列分析，發(fā)現(xiàn)其種間序列差異(32.3%～48.4%）大于cox1基因種間序列差異(20.4%～22.2%），表明線粒體nad4基因進(jìn)化較快，比cox1基因更加適合用于寄生蟲(chóng)分類地位的研究，這與Blouin等分析20種線蟲(chóng)的cox1和nad4序列結(jié)果一致[10]。本研究結(jié)果表明，O.turkestanicum屬于非洲血吸蟲(chóng)種群，這為進(jìn)一步研究血吸蟲(chóng)的起源提供了參考。

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Molecular phylogeny ofOrientobilharzia turkestanicumbased on nucleotide sequences of mitochondrialnad4gene

WANG Yu1,XIAO Jing-yin2,WANG Chun-ren1*,GAO Jun-feng1,ZHU Xing-quan3
(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China;2.College of Basic Medicine,Jiamusi University,Jiamusi 154007,China;3.College of Veterinary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China）

To determine the molecular phylogeny ofOrientobilharzia turkestanicumbased on nucleotide sequences of mitochondrialnad4gene encoding NADH dehydrogenase subunit 4,thenad4gene was amplified by PCR using the specific primers,sequenced and compared with related schistosomes in GenBank.The results showed that the nad4 sequence was 1 030 bp in length and shared 51.6%to 66.7%homology amongO.turkestanicumandschistosomaspecies.The phylogenetic tree revealed thatO.turkestanicumbelonged to african schistosome group.

Orientobilharzia turkestanicum;mitochondrial DNA;nad4;molecular phylogeny

S852.735

A

1008-0589(2010）03-0218-03

*Correspondingauthor

2009-08-23

廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放項(xiàng)目；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.11511253）

王 宇(1984-），女，黑龍江哈爾濱人，研究方向?yàn)楂F醫(yī)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病學(xué).

*通信作者：E-mail：chunrenwang@yahoo.com.cn

(本文編輯：陳立群）