姜永厚，商晗武，徐 輝，朱良俊，丁先鋒，陳偉杰，趙靈燕，方 立

(1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310018；2.中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310018；3.浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，浙江杭州310020；4.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310029)

豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)，豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)和豬圓環(huán)病毒 2型(Porcine circovirus type 2，PCV-2)是引起繁殖和/或呼吸障礙的重要病原。在集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)豬同時感染上述兩種或兩種以上的病毒病原體時，會出現(xiàn)較嚴(yán)重的臨床癥狀和病變[1-2]。豬圓環(huán)病毒1型(PCV-1)和PCV-2都屬于圓環(huán)病毒科，PCV-1被認(rèn)為是PK-15細胞系的污染物，并不具有致病性[3]。盡管兩者致病性差異很大，但它們的基因組非常相似，序列同源性超過80%[4]。因此PCV-1也包括在本研究中。

單重PCR或RT-PCR已被用于檢測和鑒定上述病毒[5-7]，但是逐個檢測幾種病毒費時費力。已有報道多重PCR能靈敏快速地檢測幾種豬病毒[8]。但由于引物對的增加，可能會導(dǎo)致非特異性反應(yīng)，結(jié)果難以判定[9]。而近年來發(fā)展起來的芯片檢測技術(shù)是一種建立在特異性核酸雜交基礎(chǔ)上，并結(jié)合PCR技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強及高通量的優(yōu)點，已被廣泛用于病原體的檢測等方面，該技術(shù)原理上可以同時檢測無限多的病原物[10-12]。

本研究建立了一種基于多重PCR的寡核苷酸基因芯片檢測和區(qū)分CSFV、PRRSV、PCV-1和PCV-2的方法，并利用標(biāo)準(zhǔn)毒株和臨床樣本對該方法的特異性和靈敏度進行了評價。

1 材料和方法

1.1 病毒株和臨床樣本 PRRSV和CSFV毒株由本實驗室保存，PCV-1和PCV-2參考株由浙江大學(xué)周繼勇教授提供。陰性對照包括牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)，無 PCV、CSFV和 PRRSV污染的 PK-15細胞購自中國獸藥監(jiān)察所，豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)二聯(lián)凍干活疫苗為哈爾濱維科生物技術(shù)公司產(chǎn)品，偽狂犬病病毒(PRV)疫苗株購自中牧實業(yè)股份有限公司。于2006年6月到2007年7月期間采集自11個農(nóng)場中的4周齡～12周齡患有呼吸和/或繁殖障礙癥狀的仔豬和流產(chǎn)胎兒的76份臨床樣本，包括淋巴結(jié)、扁桃體、肺和脾，經(jīng)PCR、實時熒光定量PCR和ELISA鑒定，由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 PCR產(chǎn)物純化試劑盒為杭州V-gene公司產(chǎn)品；pGEM-T載體為Promega公司產(chǎn)品；RNA/DNA抽提試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、dNTP、蛋白酶K，均為上海生工生物技術(shù)公司產(chǎn)品；大腸桿菌E.coliDH5α，馬鈴薯18S rRNA基因重組質(zhì)粒由本實驗室保存。

1.3 寡核苷酸探針和引物的設(shè)計 根據(jù)GenBank登錄的PCV-1、PCV-2、PRRSV和 CSFV的序列，選擇保守序列和變異序列作為診斷區(qū)域，設(shè)計種特異性引物和種與型特異性探針。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)以下設(shè)計原則進行設(shè)計探針：1、長度為22個～30個堿基；2、該探針在較窄范圍的熔解溫度(Tm)，在65℃到75℃間；3、基因型之間的同源序列有2個以上的錯配。在診斷區(qū)域的保守序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PCV-1和PCV-2通用的上游引物和下游引物。將一條基于馬鈴薯18S rRNA基因的寡核苷酸和一條用于雜交的Cy5標(biāo)記的互補鏈作為陽性對照。兩條和目的片段無相似性的植物病毒探針作為陰性對照。并用BLAST分析所設(shè)計的探針序列的特異性。在每個探針的5'端添加了poly T10尾并氨基化，以便于和醛基化的玻璃表面共價結(jié)合。所設(shè)計的PCR引物及探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物和探針及其特性具體見表1。

1.4 芯片制作 利用芯片點樣儀將10 μM寡核苷酸探針液(1×SSC為150 mM NaCl，15 mM的檸檬酸鈉，pH7.0)點制于醛基化的玻璃片上，每個點20 nL，每一條寡鏈核苷酸探針重復(fù)點3次。點樣時濕度維持在70%～75%之間，避免點樣液的快速蒸發(fā)，以便氨基化的寡核苷酸探針與玻片表面的醛基充分聯(lián)結(jié)。一張玻片點制兩個相同PCV陣列，以同時檢測兩份樣品。點樣之后，將芯片放在點樣儀里水合2 h，75℃烘干30 min。將點制的芯片用新鮮配置的含1%NaBH4的0.01 M磷酸緩沖液孵育30 min，用0.2%的SDS溶液洗滌1 min，用蒸餾水洗滌2次，每次1 min，以洗去未結(jié)合的寡核苷酸探針。制備的芯片于室溫干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 設(shè)計的寡核苷酸引物和探針及其特性Table 1 List of primers and probes sequences,Tm,coordinate and intended specificity for the primers and probes used in this study

1.5 反轉(zhuǎn)錄 在cDNA的合成中，2 μL病毒RNA/DNA加入總體積為20 μL的反應(yīng)體系中，包括4 μL的 5×反轉(zhuǎn)錄酶buffer，dNTP 0.5 mM，1.25 μM的CSFR和PRSR，20 u的核糖核酸酶抑制劑和5 u的AMV反轉(zhuǎn)錄酶。42℃下反應(yīng)60 min，然后在94℃下變性3 min，后置于冰上備用。

1.6 PCR擴增 PCR反應(yīng)總體積為 25 μL。PCR擴增反應(yīng)程序：94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃7 min。PCR產(chǎn)物進行2.5%瓊脂糖電泳，EB染色和凝膠成像檢測。

1.7 模板質(zhì)粒的構(gòu)建 構(gòu)建含有特異病毒靶標(biāo)的質(zhì)粒用于基因芯片的檢測靈敏度測定。將單個病毒擴增產(chǎn)物(表1)經(jīng)PCR產(chǎn)物純化后分別克隆至pGEM-T載體，重組質(zhì)粒提取并分別經(jīng)PCR和DNA測序驗證。用分光光度計測定重組質(zhì)粒DNA濃度。

1.8 目的片段標(biāo)記 擴增反應(yīng)的標(biāo)記按照上述PCR反應(yīng)系統(tǒng)進行，不同的是用10 nM dCTP和4 nM Cy5-dCTP代替200 mM dCTP，或2 μL重組質(zhì)粒代替2 μL病毒DNA或cDNA。PCR產(chǎn)物用0.1倍體積3 M NaAc和2倍體積的無水乙醇在-20℃沉淀2 h。沉淀物空氣中干燥后用20℃L的1×雜交緩沖液對該沉淀物重新溶解。用相同的方法處理陽性對照。

1.9 雜 交 雜交前，將10 μL Cy5標(biāo)記的PCR產(chǎn)物和10 μL Cy5標(biāo)記的陽性對照混合，于95℃變性5 min，然后在冰上迅速冷卻5 min。將混合物均分成兩份，每份10 μL，分別加于芯片兩個區(qū)域，然后蓋上蓋玻片(1.8 cm×1.8 cm)，45℃雜交1.5 h，用含0.1%SDS的0.2×SSC洗滌玻片5 min，再用0.1×SSC洗滌5 min，吸耳球吹干。

1.10 信號檢測和數(shù)據(jù)分析 雜交結(jié)束后用GenePix 4100A掃描儀對該寡核苷酸芯片進行掃描，激發(fā)波長為635 nm，PMT電壓為750，掃描分辨率為10 μm。用GenePix Pro 5.0軟件對每個點的熒光信號進行測量，分析該寡核苷酸芯片。當(dāng)探針熒光強度值大于1000，并且信噪比SNR(探針熒光強度值/局部背景熒光強度值)大于1.5時，判定為陽性。

2 結(jié) 果

2.1 診斷區(qū)選擇和靶標(biāo)基因片段制備 在對PCV、PRRSV和CSFV序列聯(lián)配的基礎(chǔ)上，在PCV復(fù)制酶基因序列內(nèi)選擇了371 bp片段，PRRSV ORF6基因內(nèi)451 bp片段，以及CSFV 5端非編碼基因內(nèi)328 bp片段作為診斷區(qū)域，另外254 bp片段的馬鈴薯18S rRNA基因片段選作陽性診斷區(qū)。瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCV、PRRSV和CSFV的單重和多重PCR均能擴增出預(yù)期大小的目的片段(圖1)。

2.2 檢測和區(qū)分 PCV-1、PCV-2、PRRSV與CSFV 標(biāo)記的病毒擴增產(chǎn)物分別與芯片雜交，與預(yù)期一致，大多數(shù)探針均特異地與對應(yīng)靶標(biāo)雜交產(chǎn)生很強的信號(圖2)。針對PCV-1特異設(shè)計的C4探針，雖然和其靶標(biāo)片段雜交時產(chǎn)生強的信號，但是在兩種基因型間也發(fā)生較強的交叉反應(yīng)。但這并不影響對雜交結(jié)果的解釋，雜交圖譜清楚地表明，該芯片技術(shù)能夠檢測并鑒別PCV基因型、PRRSV和CSFV。而且，當(dāng)其它的一些常見病毒，如BVDV，TGEV，PEDV和PRV，用同樣的引物進行標(biāo)記擴增和雜交時，均無陽性信號產(chǎn)生，進一步證實了該芯片的特異性。

基因芯片靶標(biāo)靈敏度通過雜交5倍系列稀釋的多重PCR產(chǎn)物進行評價?；蛐酒蓹z測低至0.08 ng/μL PCR 產(chǎn)物(PCV-2)，相當(dāng)于 8×107拷貝數(shù)/μL；而瓊脂糖凝膠檢測低限為2 ng/μL PCR產(chǎn)物。表明基因芯片檢測的靈敏度大約是瓊脂糖凝膠電泳的25倍。通過多重PCR擴增系列稀釋的含靶標(biāo)片段的質(zhì)粒和芯片雜交，得到基于多重PCR的基因芯片檢測模板靈敏度為1.6×104PCV-2拷貝數(shù)/μL，1.6×105PRRSV 拷貝數(shù) /μL，1.6×104CSFV 拷貝數(shù) /μL，比瓊脂糖凝膠電泳靈敏約10倍。實驗重復(fù)3次，均獲得了類似的結(jié)果。

2.3 芯片的臨床應(yīng)用 利用建立的基因芯片方法對76個臨床樣本進行了 PCV-1，PCV-2，CSFV和PRRSV檢測，然后使用同樣的3對特異性引物進行單重PCR/RT-PCR檢測以及陽性樣本的PCR產(chǎn)物DNA測序進行驗證，兩者結(jié)果符合率為100%。與以前的鑒定結(jié)果基本一致，基因芯片檢測陽性的41個樣本PCR也為陽性，基因芯片檢測陰性的35個樣本中有2個樣本為熒光定量PCR檢測PRRSV陽性。25個樣本同時感染其中2或3個病毒(表2)。

表2 基因芯片檢測76個臨床樣本3種病毒感染Table 2 Frequency of the three viruses alone or in combination in 76 clinical specimens detected by the multiplex PCR based oligonucleotide microarray

3 討論

探針的選擇和設(shè)計是基因芯片檢測病原物非常重要的一個環(huán)節(jié)，許多與探針設(shè)計有關(guān)的因素影響芯片測定的可靠性，尤其對特異性和靈敏度[13]。使用寡核苷酸探針與標(biāo)記目的片段進行雜交，是一種常見的芯片技術(shù)平臺。研究表明長15 mer到30 mer的短寡核苷酸探針可以區(qū)分親緣關(guān)系很近的病毒，甚至可以識別出多態(tài)位點[12,14]。在本實驗中，我們在每一診斷區(qū)域設(shè)計了4條～5條長22 mer至30 mer的寡核苷酸探針來檢測和鑒別PCV、PRRSV和CSFV。所有和靶標(biāo)片段完全匹配的型或種特異性探針與另一個基因型或其它病毒的相應(yīng)序列至少有4個堿基錯配，除C4探針外其它探針均特異地產(chǎn)生很強的雜交信號。盡管Wang等研究認(rèn)為3個堿基的錯配就可以防止交叉雜交[12]，但本研究中C4探針在PCV基因型間產(chǎn)生較強的交叉雜交，可能是由于錯配在另一基因型的診斷區(qū)稀疏的分布。在預(yù)試驗中我們針對每種病毒設(shè)計了7條～10條探針，但幾條探針產(chǎn)生假陰性或虛弱信號[15]。這可能是由于在靶標(biāo)片段內(nèi)部相應(yīng)區(qū)域形成了穩(wěn)定的二極結(jié)構(gòu)而阻止了探針與之結(jié)合，因此無法檢測到雜交信號。Peplies等添加可結(jié)合到探針結(jié)合位點附近的未標(biāo)記輔助寡核苷酸，使探針與原結(jié)合位點的結(jié)合有所增加，證實了這種猜測[16]。

靈敏度是衡量基因芯片臨床應(yīng)用水平的一個重要指標(biāo)之一。本試驗中用基因芯片檢測擴增靶標(biāo)片段的靈敏度是瓊脂糖凝膠電泳的25倍左右，而基于多重PCR的基因芯片檢測模板靈敏度比瓊脂糖凝膠電泳靈敏約10倍，與其它文獻報道結(jié)果相近[9]。另外，如果將更多的Cy5-dCTP加入擴增標(biāo)記反應(yīng)，會進一步提高檢測靈敏度，而且，用單鏈DNA樣品代替雙鏈DNA進行雜交，也可提高雜交信號的強度[14]。因此，建立在PCR基礎(chǔ)上的基因芯片技術(shù)是一種更加靈敏的檢測技術(shù)。

除了具有同時檢測微量樣品中多種病原物的能力，基因芯片技術(shù)可方便地獲得特異的探針，而且根據(jù)需要，通過設(shè)計靶標(biāo)探針，更多的檢測病原物可以添加到這個系統(tǒng)，目前本實驗室正開展此方面的研究。

與基于凝膠電泳的多重PCR方法相比，基于多重PCR的基因芯片檢測方法另一個優(yōu)點是不需要設(shè)計不同的擴增產(chǎn)物大小。本研究中設(shè)計了不同大小的擴增產(chǎn)物僅為了與基于凝膠電泳的多重PCR方法比較。為多重PCR設(shè)計不同大小的擴增產(chǎn)物是一項復(fù)雜的程序，而且不同大小的擴增產(chǎn)物可能導(dǎo)致不同的擴增效率。

本研究對所述幾種豬病毒對疑似呼吸和/或繁殖障礙癥狀的76個樣品進行了檢測。基因芯片檢測結(jié)果與PCR、熒光定量PCR和ELISA的結(jié)果基本一致，2個熒光定量PCR檢測PRRSV陽性的樣本基因芯片檢測陰性，可能是由于是兩者靈敏度的差異。在中國多個地區(qū)發(fā)現(xiàn)混合感染PRRSV/PCV-2，PCV-1/PCV-2或PRRSV/CSFV[17-20]。本研究獲得的數(shù)據(jù)亦表明，同時感染2種或3種上述病毒比較普遍。

總之，基于多重PCR的基因芯片方法對于檢測和確定豬群感染一種或多種病毒是一種省時、省力的有效方法，本研究建立的基因芯片檢測方法可用于豬病流行病學(xué)調(diào)查以及實驗室臨床分離株的鑒定。

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