馬麗娟,王婷婷

(寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,寧夏銀川66865380)

麥冬多糖提取工藝的研究*

馬麗娟,王婷婷

(寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,寧夏銀川66865380)

以麥冬總多糖百分含量為指標(biāo),采用正交設(shè)計對用熱水浸提醇沉法提取麥冬多糖的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)選研究。在提取過程中,根據(jù)單因素實驗確定了醇沉?xí)r乙醇的用量為濃縮液體積的5倍,含量測定時的最佳顯色時間為15min;設(shè)計L9(33)正交實驗,利用苯酚-硫酸法進(jìn)行含量測定,重點考察加水量、提取溫度和提取次數(shù)對提取效果的影響。結(jié)果顯示提取麥冬多糖的優(yōu)選工藝條件為加12倍量水,70℃水浴,提取3次,總多糖含量為67.83%。

麥冬多糖;正交試驗;提取工藝;含量測定

麥冬(Ophiopogon japonicus)首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,系百合科沿階草屬多年生常綠草本植物麥冬的塊根,在我國大部分地區(qū)均有野生分布和栽培,其著名產(chǎn)地有四川三臺(川麥冬)和浙江杭州(杭麥冬)。麥冬主要化學(xué)成分為甾體皂甙、多糖、高異黃酮類、氨基酸等[1]。

麥冬多糖是從麥冬塊根中提取的,總多糖由葡萄糖、果糖兩種單糖組成。近年來的麥冬多糖藥理作用的研究表明,作為麥冬的主要成分之一,麥冬多糖具多種藥效,如具有抗心律失常,促使胰島細(xì)胞的恢復(fù),促進(jìn)抗體、補(bǔ)體、溶菌酶等的產(chǎn)生等作用[2]。長期以來,麥冬多糖作為滋陰類中藥在臨床上得到廣泛使用,其具有的多種藥理活性已經(jīng)引起人們的廣泛興趣和關(guān)注。麥冬多糖的提取工藝已有較多的研究,目前多采用的方法是用95%乙醇或甲醇加熱回流提取以除去單糖、低聚糖及脂溶性成分,后加水提取其中的多糖類成分。

本實驗以麥冬多糖百分含量為指標(biāo),采用熱水浸提醇沉法提取麥冬多糖,設(shè)計L9(33)正交實驗,根據(jù)苯酚-硫酸法[3]對其進(jìn)行含量測定,重點考察加水量、提取溫度和提取次數(shù)對提取效果的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 麥冬:購于寧夏銀川市西夏區(qū)同心路寧和醫(yī)院。

1.1.2 試劑葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品:西安化試劑廠

苯酚(分析純):萊陽市雙雙化工廠;

濃硫酸(分析純):無錫市展望化工試劑有限公司

1.1.3 儀器植物粉碎機(jī):天津市泰斯特儀器有限公司,型號FZ102;

數(shù)顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司,HH-2型;

水循環(huán)式多用真空抽濾機(jī):鄭州長城科工貿(mào)有限公司;

721 分光光度計:上海第一分析儀器廠;

干燥箱;電子天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將麥冬藥材置于60℃干燥箱中烘干,使用植物粉碎機(jī)將其進(jìn)行粉碎,密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 麥冬多糖含量的測定

參照文獻(xiàn)使用苯酚-硫酸法測定多糖含量。此法是先用葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后,再通過多糖顯色反應(yīng)測定吸光度,然后根據(jù)其在曲線上的位置推算出多糖的濃度從而推算其含量。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.041g,用蒸餾水將其溶解定容到100mL容量瓶中,混勻。分別精密量取該葡萄糖溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL至10mL容量瓶中,加水定容得到標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。

表1 最大吸收波長的測定

1.2.2.2 6%苯酚水溶液的配制

稱取苯酚50.0g,加鋁片0.1g和碳酸氫鈉0.05g,蒸餾,準(zhǔn)確稱取178℃餾分時的苯酚9g,加水150mL溶解,配成6%苯酚水溶液。置棕色瓶中保存,備用[4]。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

量取上述2號標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液2.0mL置于干燥燒杯中,加入6%苯酚溶液1.0mL搖勻,然后加入濃硫酸5.0mL搖勻,另取上述1號2.0mL同法操作作為空白對照,于沸水浴中顯色15min,取出自然冷卻至室溫,利用721分光光度計,在450530nm之間測定吸光度,結(jié)果在492nm處有最大吸收,因此選擇測定波長為492nm。見表1。

分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0mL于干燥燒杯中,分別加入1.0mL 6%苯酚溶液和5.0mL濃硫酸,搖勻。于沸水浴中恒溫顯色15min,自然冷卻至室溫,以1號為空白對照,在492nm波長處測定吸光度。以吸光度對濃度作工作曲線,得到線性方程:A=0.05757+0.01308C。見圖1。

1.2.2.4 單因素實驗

醇沉乙醇用量的影響 稱取經(jīng)粉碎的麥冬2g四份,各加入10倍量水,于70℃水浴中浸提60min,取出抽濾,濾液濃縮至10mL,分別加入95%乙醇40、50、60、70mL,靜置醇沉3h。棄去上清夜,將沉淀置于 60℃烘箱中干燥 30min,取出加水溶解,于250mL容量瓶中定容,再移取1mL于另一250mL容量瓶中稀釋至刻度。按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項下方法測定其吸光度并計算多糖含量,結(jié)果見表2。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 乙醇用量的影響

顯色時間的確定稱取經(jīng)粉碎的麥冬2g四份,各加入10倍量水,于70℃水浴中浸提60min,取出抽濾,濾液濃縮至10mL,加入95%乙醇50mL,靜置醇沉3h。棄去清夜,將沉淀置于60℃烘箱中干燥30min,取出加水溶解,于250mL容量瓶中定容,再移取1mL于另一250mL容量瓶中稀釋至刻度。各移取2.0mL分別置于干燥燒杯中,依次加入1mL6%苯酚和5mL濃硫酸,搖勻并分別置于沸水浴中顯色5、10、15、20min,自然冷卻至室溫,492nm波長下測定其吸光度并計算含量如表3。

表3 顯色時間的影響

1.2.3 正交實驗設(shè)計

選取加水量(A)、提取溫度(B)、提取次數(shù)(C)作為考察因素,每個因素擬定3個水平,見表2-4,選用L9(33)正交表,實驗安排見表5。

表4 因素水平表

表5 L9(33)正交設(shè)計表

1.2.3.1 多糖的提取

用天平稱取9份2g粒度均勻的麥冬,分別按正交實驗設(shè)計表(表2-5)的安排進(jìn)行實驗,實驗過程中,根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,各實驗項下的提取液均濃縮到10mL,醇沉乙醇用量為50mL,顯色時間為15min。

1.2.3.2 含量測定

移取樣品2.0mL按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項下步驟操作,測定吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算麥冬多糖含量,結(jié)果見表6。

表6 正交實驗結(jié)果

實驗號 因素A B C 吸光度 麥冬總多糖含量(%) 麥冬用量(g) 6 2 3 1 0.255 47.12 2.002 7 3 1 3 0.350 67.83 2.060 8 3 2 1 0.330 64.13 2.030 9 3 3 2 0.282 51.36 2.088 K1 52.49 58.32 55.63 K2 51.05 55.58 50.30 K3 61.11 50.75 58.72 R 10.05 7.57 8.42

K1一水平試驗結(jié)果總和的平均值

K2二水平試驗結(jié)果總和的平均值

K3三水平試驗結(jié)果總和的平均值

R:極差,反映了同一因素取不同水平時,試驗結(jié)果的變化幅度,變化幅度越大,說明該因素對試驗結(jié)果的影響越大,它就越重要。

以上正交試驗結(jié)果表明,各因素對試驗結(jié)果影響的程度依次為:A>C>B,即加水量>提取次數(shù)>提取溫度。綜合各種因素考慮,確定最優(yōu)工藝條件為A3B1C3。

1.2.3.3 追加驗證試驗結(jié)果

1.2.3.3.1 重現(xiàn)性實驗

精密量取2.0mL正交試驗中7號樣品溶液5份,按含量測定方法依法獨立測定樣品含量,以考察本法的重現(xiàn)性,見表7。測定的平均值結(jié)果為67.87%,RSD為0.288%。

表7 重現(xiàn)性實驗

1.2.3.3.2 工藝條件驗證實驗

稱取2.0g麥冬藥材5份,分別加12倍量水,于70℃水浴中提取3次,每次30min,合并各份提取液并濃縮至10mL,分別加入95%乙醇50mL靜置醇析,取沉淀于60℃烘箱中烘干,按照優(yōu)選方案項下溶解并稀釋,根據(jù)含量測定方法依次測定,其結(jié)果見表8。測得多糖得率平均值為67.55%,RSD為0.292%,表明該工藝穩(wěn)定可靠。

表8 工藝驗證

1.2.3.3.3 穩(wěn)定性實驗

取工藝驗證試驗中5號樣品溶液2mL,按照含量測定方法操作,每隔20min測一次光度,其結(jié)果見表9,RSD為1.01%,表明測定值在120min內(nèi)保持穩(wěn)定。

表9 穩(wěn)定性實驗

1.2.3.3.4 加樣回收實驗

1.稱取2.0g麥冬按照工藝驗證步驟操作,測得吸光度為0.35,計算得第一次定容的濃度為5589.26μg/mL。

2.待加葡萄糖溶液 稱取0.6g葡萄糖于燒杯中溶解,轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中定容至刻度,搖勻備用。

3.量取第一次定容的麥冬多糖溶液0.5mL于250mL容量瓶中,加入0.5mL上述葡萄糖溶液,加蒸餾水至刻度搖勻。取5個燒杯,分別移入2mL此溶液,依法測定其吸光度,計算回收率見表10。結(jié)果均值為96.72%,RSD為2.31%。

表10 回收率實驗

結(jié)果分析:在同等條件下,追加驗證試驗的多糖含量均無明顯差異.因此優(yōu)選的麥冬多糖的提取工藝條件為最佳工藝.

2 討論

本研究主要是采用正交實驗分析結(jié)果,正交實驗是研究多因素、多水平的一種設(shè)計方法,它能夠在因素變化范圍內(nèi)均衡抽樣,并且使每次實驗都具有較強(qiáng)的代表性。正是由于正交實驗具備均衡分散的特點,所以保證了全面實驗的某些要求,而這些實驗往往能夠較好或更好的達(dá)到實驗?zāi)康?。換句話說,只需采用較少的實驗次數(shù),即可獲得最佳的方案。

據(jù)文獻(xiàn)報道,苯酚-硫酸比色法和蒽酮-硫酸比色法為多糖含量測定的兩種經(jīng)典的方法。由于苯酚相對價廉,且苯酚液配制以后只要放在冰箱冷藏起來,一般不會影響測定結(jié)果[5]。故選用苯酚-硫酸比色法作為麥冬多糖的含量測定方法。

本實驗優(yōu)選出的麥冬多糖提取工藝條件為加12倍量水,70℃水浴,提取3次,總多糖含量為67.83%。該工藝操作簡單,經(jīng)濟(jì)可行,為麥冬多糖熱水浸提醇沉工藝的選擇提供了參考。

[1]范俊,張旭.麥冬多糖藥理研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2006,24(4):626-627.

[2]齊建紅,陶貴榮,郭新軍等.麥冬多糖的生物活性研究進(jìn)展[J].西安文理學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,2008,11(1):44-46.

[3]馮怡,韓寧,徐德生等.麥冬多糖含量測定方法的研究[J].中成藥,2006,28(5):705-707.

[4]王桂玲,房建強(qiáng),趙雪梅等.麥冬多糖水提醇沉工藝研究[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007,28(8): 603-605.

[5]呂麗娟,馬明輝,貢濟(jì)宇等.正交實驗法優(yōu)選麥冬多糖提取工藝[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2007,23(2):30-31.

[責(zé)任審校:秦春娥]

R944.1

A

1672-1047(2010)04-0026-05

10.3969/j.issn.1672-1047.2010.04.07

2010-05-27

馬麗娟,女,副教授。E-mail:malj@nxu.edu.cn.