付英杰，田景振

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南 250355)

阿膠低肽酶解液超濾工藝的實驗研究

付英杰，田景振*

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南 250355)

阿膠;低肽;酶解;超濾

目的:優(yōu)選阿膠低肽酶解液的最佳超濾工藝。方法:通過考察超濾膜材質(zhì)、酶解液的預(yù)處理方法、藥液濃度、分子量截留值、操作壓力及溫度等因素對透過速率的影響，優(yōu)選最佳工藝條件。結(jié)果:最佳超濾工藝為:取50 g阿膠粉制成阿膠低肽酶解液，稀釋至1 000 mL，水浴預(yù)熱至40℃，在柱壓(0.15±0.01)MPa下分別經(jīng)過截留分子量30 kD、3 kD的超濾膜超濾，并水洗一次。結(jié)論:該超濾工藝損失少、快速、高效。

阿膠為馬科動物驢Equus asinusL.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠。性味甘、平，歸肺肝腎經(jīng)，功能補血、止血、滋陰潤燥，主治血虛證。阿膠主含膠原蛋白，但膠原蛋白的消化吸收需要蛋白酶參與降解，而適應(yīng)癥患者則常見脾胃虛弱或胃腸道反應(yīng)，服用阿膠不僅會造成患者消化系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)，而且藥效也得不到充分的發(fā)揮，因此需將阿膠進行酶解，制成分子量低于3 kD的小分子肽，但阿膠經(jīng)酶解后，酶解液中仍殘存大分子蛋白。為此，筆者采用超濾法將此部分蛋白與小分子肽進行分離，并考察其影響因素及損失率，現(xiàn)報道如下:

1 儀器與試劑

1.1 儀器

中空纖維超濾膜(北京市旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司)，紫外分光光度計(日立UV－3010)。

1.2 試劑

牛血清白蛋白(Albumin，Bovine Biotech，購于上海生工生物工程有限公司，批號:B67328);考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue G－250 Ultra Pure，購于上海生工生物工程有限公司，批號:0241B75);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 超濾膜使用條件的優(yōu)選

2.1.1 超濾膜材質(zhì)

阿膠酶解液性質(zhì)較為稠厚，采用普通超濾膜易形成凝膠層，容易堵塞。故選用不易堵塞、易清洗、可反復(fù)利用，且對藥液穩(wěn)定性好的中空纖維膜。

2.1.2 酶解液的預(yù)處理

膜材內(nèi)孔徑甚小，藥液流經(jīng)膜面時，小分子通過膜而大分子物質(zhì)則被截流，而沉積于膜面，組成一層致密的凝膠層，成為次級膜，阻礙分子量小于膜孔的物質(zhì)通過?？紤]到中藥提取液為混懸體系，極易形成凝膠層，最好進行預(yù)處理［1］。

方法:按表1中的預(yù)處理方法對阿膠酶解液(MWt.＜3 kD低肽濃度為77.67 μg/mL)進行預(yù)處理，處理后的藥液采用考馬斯亮藍(lán)法［2］測定MWt.＜3 kD低肽含量，結(jié)果見表1。

表1 阿膠提取液預(yù)處理方法實驗結(jié)果

綜合考慮，采用過單層濾紙的方法較為可行，但是濾速較慢，故采用先離心后抽濾的方法進行初精制。結(jié)果:濾速增加，效果較好。

2.1.3 膜截留值與膜孔徑

超濾膜的孔徑是以截留(95%)特定物質(zhì)的相對分子量來表示的。阿膠酶解液的有效成分為分子量＜3 kD的低肽，但若直接采用分子量截留值為3 kD的中空纖維膜超濾，膜易堵，難以清洗且損失大，因此依次采用30 kD、3 kD的超濾膜超濾。

2.1.4 藥液濃度

超濾的藥液濃度不可過高，因為過高易形成凝膠層，使超濾膜的透過速率降低;也不可過低，過低則影響考馬斯亮藍(lán)測定，并延緩超濾時間［1］。

方法:將200 g阿膠粉制得的酶解液分別稀釋制成相當(dāng)于原藥材0、25、50、75、100、125、150、175、200 g/L的藥液，分別通過中空纖維超濾膜(分子量截留值為30 kD)，壓力為0.15 MPa，測定5 min內(nèi)的透過速率(mL/min)，結(jié)果見表2。

表2 藥液濃度對透過速率的影響

由表2可知，藥液濃度升高，超濾速度大幅降低，所以應(yīng)將藥液的濃度控制為原藥材的25～50 g/L再進行超濾，后續(xù)實驗采用將50 g阿膠粉制得的酶解液稀釋至1 000 mL再進行超濾。

2.1.5 操作壓力

超濾過程是以壓力為驅(qū)動力的分離過程，所以操作壓力是影響分離過程的主要因素之一。壓力過大，可能會造成超濾器中空纖維膜纖維絲的斷裂或癟塌;壓力過低則影響流通量［3］。故需要考察操作壓力的大小。又因為中空纖維柱的透過速率會隨操作時間的延長有變化，所以也需要考察不同操作壓力下透過速率隨時間的變化。

方法:將50 g阿膠粉制得的酶解液稀釋至1 000 mL，按表3中的操作壓力，通過中空纖維超濾膜(分子量截留值為30 kD)，測定5 min內(nèi)的透過速率(mL/min)。超濾過程中操作壓力與透過速率的關(guān)系見表3。

表3 超濾過程中操作壓力與透過速率的關(guān)系

由表3可知，5 min內(nèi)透過速率以在操作壓力以0.12～0.18 MPa為最佳，操作壓力超過0.18 MPa后透過速率開始下降，需要進一步考察操作壓力對膜透過速率隨時間的影響。

方法:將50 g阿膠粉制得的酶解液稀釋至1 000 mL，按照表4中的3個操作壓力，通過中空纖維超濾膜(分子量截留值為30 kD)，時間安排如表4，測定每隔5 min的透過速率(mL/min)，結(jié)果見表4。

表4 操作壓力對膜透過速率隨時間的影響(mL/min)

由表4可知，壓力為0.15 MPa時該阿膠藥液的透過速率較高，且隨著超濾的進行，透過速率下降較慢，故超濾最適宜的壓力范圍為(0.15±0.01)MPa。

2.1.6 藥液溫度的影響

由于本實驗超濾膜為中空纖維膜，使用溫度要求低于45℃，據(jù)文獻報道［4］，溫度在11～43℃時，隨料液溫度的升高，膜透過速率呈明顯上升趨勢，且在超濾過程中，溫度高的料液其透過速率始終大于低溫料液。但是，溫度過高會導(dǎo)致藥液中的有效成分變性。為了加快超濾速度，我們在膜材料及被處理料液允許的溫度范圍內(nèi)，盡可能采用較高的溫度即40℃。

2.2 超濾工藝的研究

方法:取50 g阿膠粉配成預(yù)實驗藥液，稀釋至1 000 mL，水浴預(yù)熱至40℃，在柱壓(0.15±0.01)MPa下經(jīng)過截留分子量為30 kD的超濾柱，將超濾液濃縮至約400 mL;將濃集液分3次水洗及1次堿洗:水洗3次的體積分別為約300，100，100 mL，之后分別收集3次水洗超濾液;堿液采用0.3% NaOH水溶液150 mL(注:堿洗為超濾柱洗滌的主要方法，在超濾液收集與實際生產(chǎn)中并無實際意義，本文僅作為一項實驗數(shù)據(jù));利用考馬斯亮藍(lán)法測定各部分總肽含量，并計算各部分占原藥液低肽含量的百分比。然后將30 kD超濾液及3次水洗液合并，定容至1 000 mL，通過截留分子量3 kD的超濾柱，實驗與檢測方法均同30 kD超濾。結(jié)果見表5。

表5 超濾損失考察實驗結(jié)果

由表5可知，30 kD和3 kD的超濾柱都至少需要水洗一次，可保證原藥液低肽含量為75%以上。因為水洗1次之后再進行水洗的效果不明顯，所以生產(chǎn)實際中可采用超濾后水洗1次的方法。

3 小結(jié)與討論

3.1 本實驗對阿膠酶解得到的低肽溶液進行了分次超濾，通過考察超濾膜材質(zhì)、酶解液的預(yù)處理方法、藥液濃度、分子量截留值、操作壓力及溫度等因素，得出最佳超濾工藝為:取50 g阿膠粉制成阿膠低肽酶解液，稀釋至1 000 mL，水浴預(yù)熱至40℃，在柱壓(0.15±0.01)MPa下分別經(jīng)過截留分子量30 kD、3 kD的超濾膜超濾，并水洗一次。

3.2 由于酶解方法較為繁瑣，操作時間長，故本實驗采用的是單因素考察法，而未進行平行實驗;關(guān)于多因素的交互作用，有待進一步研究。

［1］黃楚華，殷學(xué)倫.超濾法制備胎盤肽的初步研究［J］.中國生化藥物雜志，1994，15(2):133.

［2］徐杰偉，溫少磊，蔡早育.考馬斯亮藍(lán)法測定微量蛋白的條件探討［J］.江西醫(yī)學(xué)檢驗，2003，21(5):353.

［3］賀立中.超濾技術(shù)在制劑生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.中國藥學(xué)雜志，1995，30(12):711.

［4］汪濤，曾慶祝，葉于明.采用超濾技術(shù)分離扇貝邊酶解液［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2002，9(3):255.

R284.2

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1001－1528(2010)07－1241－03

2009－08－14

付英杰(1983－)，男，博士研究生。Tel:(0531)89628597 E－mail:pilipili@163.com