尹崇高，李若葆，李洪利，楊曉

(1.山東省濰坊醫(yī)學(xué)院護理學(xué)院，濰坊 261053;2.濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，濰坊 261053; 3.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實驗中心，濰坊 261053)

研究報告

被動吸煙下調(diào)大鼠卵巢雌、孕激素及其受體的表達

尹崇高1，李若葆2，李洪利3，楊曉1

(1.山東省濰坊醫(yī)學(xué)院護理學(xué)院，濰坊 261053;2.濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，濰坊 261053; 3.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實驗中心，濰坊 261053)

目的利用W istar大鼠煙霧吸入模型，觀察被動吸煙對W istar大鼠卵巢結(jié)構(gòu)的影響，檢測生殖激素水平，分析生殖內(nèi)分泌的變化，為提倡生育期婦女避免被動吸煙提供新的理論依據(jù)。方法建立大鼠煙霧吸入模型。32只健康雌性W istar大鼠，鼠齡(60±5)d，每只體重200～250 g，隨機分為空白對照組和實驗組，每組16只。實驗組吸煙3個月，對照組正常飼養(yǎng)。3個月后處死兩組大鼠。酶聯(lián)免疫吸附試驗方法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測雌鼠血清中雌激素(estrogen，E2)、孕激素(progesterone，P4)的水平;常規(guī)石蠟切片，免疫組織化學(xué)SP法檢測各組雌鼠卵巢雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)的表達情況。所得數(shù)據(jù)采用SPSS軟件作統(tǒng)計學(xué)處理分析，比較各組間差異程度。結(jié)果①酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果:吸煙3個月大鼠血清E2水平比空白對照組顯著降低，其濃度值比較差異有顯著性;吸煙3個月大鼠血清P4水平比空白對照組顯著降低，其濃度值比較差異有顯著性。②免疫組織化學(xué)結(jié)果:ER主要表達在大鼠卵巢組織的各級生長卵泡的顆粒細胞的細胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒狀分布，卵泡膜細胞和間質(zhì)細胞也有少量表達。吸煙3個月的大鼠卵巢組織中ER的表達顯著低于空白對照組。PR主要表達在大鼠卵巢組織卵泡的顆粒細胞的細胞質(zhì)和細胞核中，呈棕黃色顆粒狀分布，吸煙3個月的大鼠卵巢組織中PR的表達顯著低于空白對照組。結(jié)論①成功的建立了大鼠被動吸煙模型。②被動吸煙可使大鼠血清中E2及P4水平明顯降低，使大鼠卵巢中ER及PR的表達減少，提示被動吸煙可破壞卵巢的功能，引起生殖內(nèi)分泌失調(diào)。

被動吸煙;卵巢;雌激素;孕激素;雌激素受體;孕激素受體

近年來，被動吸煙對非吸煙婦女生殖健康的危害，引起越來越多的國內(nèi)外學(xué)者重視。他們認為環(huán)境煙草煙氣中有很多有害物質(zhì)如苯、鉛、錳、多環(huán)芳烴等可對女性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生損害作用。這些損害表現(xiàn)為:①循環(huán)雌激素、孕激素減少。②對卵泡發(fā)育的影響。Bordel等［1］研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁能通過誘導(dǎo)細胞的凋亡而抑制卵泡的發(fā)育。尼古丁、鎘和多環(huán)芳烴類物質(zhì)可使卵泡成熟率降低，成熟的卵母細胞數(shù)目減少，造成婦女生殖能力下降，卵子儲備量下降［2］。卵泡刺激素升高是卵子儲備量低下的表現(xiàn)。Cooper等［3］對290名婦女檢測發(fā)現(xiàn)，吸煙婦女的卵泡刺激素比被動吸煙婦女高39%，較不吸煙者高60%。透明帶圍繞在卵母細胞周圍，在卵母細胞受精前后、胚胎孵化及種植過程中起著重要的作用。受精后胚胎的透明帶變硬，然后逐漸變薄，透明帶變薄易于胚胎孵出。以往的研究僅限于流行病學(xué)分析和體外實驗對女性的生殖系統(tǒng)的影響，但模擬年輕女性被動吸煙，研究被動吸煙對卵巢內(nèi)分泌功能的影響尚無報道。

本實驗通過建立大鼠被動吸煙模型，酶聯(lián)免疫法檢測血清雌激素、孕激素的水平，免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測雌激素受體、孕激素受體在卵巢組織中的表達，并與未吸煙對照組進行比較，探討被動吸煙對卵巢生殖內(nèi)分泌功能的影響，為提倡生育期婦女避免被動吸煙提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

實驗動物采用健康、性成熟、未交配過的雌性SPF級W istar大鼠，鼠齡(60±5)d，體質(zhì)量200～250 g，來源于山東大學(xué)實驗動物中心［SCXK(魯) 2003－0004］，實驗期間提供足量的自來水及山東大學(xué)動物實驗中心提供的普通飼料，動物室溫度保持在22℃左右，自動通風(fēng)，光照周期8:00－18:00，適應(yīng)3 d后用于實驗。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 實驗主要試劑

大鼠E2、P4ELISA檢測試劑盒購自美國ADL公司;兔抗大鼠ER、PR多克隆抗體購自Santa－Cruz公司;SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的制備與分組:健康性成熟未交配過的雌性SPF級W istar大鼠32只，鼠齡(60±5)d，體質(zhì)量200～250 g，隨機分為2組，即吸煙組和正常對照組，每組16只，正常對照組在正常呼吸空氣條件下飼養(yǎng)，吸煙組給予煙霧吸入。將每組大鼠分籠喂養(yǎng)，給基礎(chǔ)飼料，注意給充足的水。參照徐凌等［4］大鼠煙霧吸入模型，利用有機玻璃、鋼架、小型風(fēng)扇等自制大鼠被動吸煙煙箱，規(guī)格:91cm×59 cm×62 cm。每天將煙霧吸入組大鼠置于煙箱內(nèi)，每次燃燒10支芙蓉香煙(湖南中煙工業(yè)公司生產(chǎn)，84 mm過濾嘴香煙，烤煙型，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.1 mg，煙氣一氧化碳量14 mg)，每支燃燒約12 min，停5～6 min，共約3 h，每天2次，每周5d，連續(xù)3個月。3個月后在動情前期處死吸煙動物和相應(yīng)的對照動物，取卵巢組織標(biāo)本進行免疫組織化學(xué)染色，取血清進行ELISA。

1.3.2 ELISA:完全按大鼠E2、P4ELISA試劑盒操作步驟進行。最后在450 nm波長處測定各孔的A值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)的濃度值。

1.3.3 免疫組化:完全按照SP免疫組化試劑盒操作說明進行。結(jié)果分析:采用醫(yī)學(xué)圖像分析軟件進行分析。將每張切片待測細胞在顯微鏡下定位后，在圖像監(jiān)視器上顯示圖像，測定該區(qū)域細胞的積分光密度(integral optical density，I A)、面積(area)的值，再隨機觀察10個視野(×200)，分別取每張切片的平均值作為該組的所測激素受體的含量值，最后以整個一組的均值作為該受體在卵巢組織表達的相對強度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測血清中激素水平

2.1.1 大鼠血清E2水平:吸煙組大鼠血清E2水平比空白對照組顯著降低，其濃度值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表1)，提示被動吸煙對大鼠血清中E2水平有影響。

2.1.2 大鼠血清P4水平:吸煙組大鼠血清P4水平比空白對照組顯著降低，其濃度值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表1)，提示被動吸煙對大鼠血清中P4水平有影響。

表1 吸煙組與對照組大鼠血清E2、P4水平(±s，n=16)Tab.1 The serum levels of E2and P4in the smoking and control rats(±s，n=16)

表1 吸煙組與對照組大鼠血清E2、P4水平(±s，n=16)Tab.1 The serum levels of E2and P4in the smoking and control rats(±s，n=16)

組別(Group) E2 P4 A值(A value)濃度(ng/m L)Concentration A值(A value)濃度(nmol/L)Concentration空白對照組(Control)1.76±1.06 35.74±30.30 1.45±0.44 68.96±26.30吸煙組(Smoking)0.95±1.10 21.02±18.65 0.92±0.69 39.98±21.36

2.2 免疫組織化學(xué)檢測卵巢ER及PR蛋白表達

ER主要表達在大鼠卵巢組織的各級生長卵泡的顆粒細胞的細胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒狀分布，卵泡膜細胞和間質(zhì)細胞也有少量表達(見圖1、2)。吸煙三個月的大鼠卵巢組織中ER的表達顯著低于空白對照組(P＜0.01，見表2);PR主要表達在大鼠卵巢組織卵泡的顆粒細胞的細胞質(zhì)和細胞核中(見圖3、4)，呈棕黃色顆粒狀分布，吸煙三個月的大鼠卵巢組織中PR的表達顯著低于空白對照組(P＜0.01，見表2)。(圖1～4見彩插6。)

表2 吸煙組與對照組大鼠卵巢ER、PR的表達情況(±s，n=16)Tab.2 The expression of ER and PR in smoking and control rats(±s，n=16)

表2 吸煙組與對照組大鼠卵巢ER、PR的表達情況(±s，n=16)Tab.2 The expression of ER and PR in smoking and control rats(±s，n=16)

組別(Group)ER PR面積(Area)積分光密度(I A)面積(Area)積分光密度(I A)空白對照組(Control)214.85±30.47 337346.74±4694.30 516.28±316.98 90992.50±50062.66吸煙組(Smoking)165.92±33.25 29164.62±6038.65 173.04±92.1530085.75±13156.50

3 討論

世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)定義被動吸煙為不吸煙者，在一周中有一天以上吸入吸煙者呼出的煙霧超過15min/d。近年來，被動吸煙對非吸煙婦女生殖健康的危害，引起越來越多的國內(nèi)外學(xué)者重視。他們認為環(huán)境煙草煙氣中有很多有害物質(zhì)如苯、鉛、錳、多環(huán)芳烴等可對女性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生損害作用。

卵巢能夠合成大量的甾體激素，主要是雌激素和孕激素。在哺乳動物，E2、P4是主要由女性/雌性性腺卵巢直接分泌的性激素，因此卵巢的功能狀態(tài)對于女性/雌性生殖組織的生長、分化以及生育功能和月經(jīng)周期/動情周期的維持具有十分重要的作用。雌激素對卵巢本身的發(fā)育是必需的，卵巢生發(fā)上皮的功能以及在皮質(zhì)各期卵泡的成長和發(fā)育均需要雌激素的存在，顆粒細胞和卵泡膜細胞既是分泌產(chǎn)生雌激素的部位，其本身也有ER，并接受雌激素的影響。排卵前卵泡液中含有一定濃度的P4，研究者推測，卵泡成熟的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能需要特殊的卵泡內(nèi)孕酮環(huán)境，通過特異性地與細胞核受體結(jié)合而產(chǎn)生作用［5］。

在成年人和哺乳動物中，E2調(diào)節(jié)卵巢功能。ER受體2種亞型均表達在卵巢中。ERβ在顆粒細胞間質(zhì)及生發(fā)上皮的核內(nèi)呈陽性表達，ERα在間質(zhì)生發(fā)上皮的核內(nèi)呈陽性表達，在顆粒細胞中呈陰性反應(yīng)。表明在卵巢生理功能調(diào)節(jié)中ERβ發(fā)揮更主要作用［6］。如果ER在卵泡內(nèi)不足，卵泡的發(fā)育、生長、成熟、激素產(chǎn)生和排卵一系列生理活動將會受限。它們不僅影響女性性征的發(fā)育、妊娠及行為，也在卵巢內(nèi)部產(chǎn)生重要影響［7］。Chen等［8］對新近結(jié)婚欲妊娠的371名不吸煙的健康婦女進行了前瞻性調(diào)查，分析344個未孕周期和329個懷孕周期兩者晨尿中雌酮結(jié)合物(estrone conjugates，E1C;雌激素的主要代謝產(chǎn)物)孕二醇－3－葡糖苷酸(pregnanediol－3－glucuronide，PdG;孕激素的主要代謝產(chǎn)物)的水平。Flouris等［9］研究發(fā)現(xiàn)暴露于二手煙的婦女，17β－雌二醇和孕激素水平明顯降低，LH和FSH水平降低。為了評估ETS對卵巢功能的直接影響，Vidal等［10］將原代培養(yǎng)的黃體顆粒細胞暴露于ETS。ETS低濃度和高濃度都使雌激素的產(chǎn)生明顯降低。在一個相似的模擬系統(tǒng)，新煙堿和尼古丁競爭性抑制芳香化酶，而芳香化酶是雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的必需酶。此外，高濃度ETS可以引起孕激素生成降低。游離尼古丁和尼古丁酒石酸氫鹽可以降低人類黃體顆粒細胞分泌孕激素。

本實驗用ELISA檢測被動吸煙大鼠與空白對照組大鼠血清中雌激素水平的改變，結(jié)果顯示被動吸煙組大鼠血清雌激素均比空白對照組明顯降低;用免疫組化方法檢測被動吸煙大鼠與空白對照組大鼠卵巢中ER的表達，結(jié)果顯示被動吸煙組大鼠ER的表達顯著低于空白對照組，提示被動吸煙可引起血清中E2含量的減少，也可引起卵巢ER的表達減少。

Gava等［11］用免疫組化檢測小鼠卵巢孕激素受體各亞型的表達，對于排卵卵泡的卵泡膜和顆粒細胞，竇前卵泡，竇狀卵泡和黃體的卵泡膜細胞上都表達PRA、PRB，而竇前卵泡、竇狀卵泡和黃體的顆粒細胞上僅表達PRB。王育華等［12］研究表明，卵巢中大量表達PRA、PRB。對PR蛋白敲除(PRKO)研究表明，PRKO小鼠不能排卵，但小鼠的卵泡是成熟卵泡，并有成熟的卵母細胞和完整的功能，能在體外受精，且排卵前的顆粒細胞能分化成黃體并能表達黃體的標(biāo)記物P450側(cè)鏈裂解酶［13］。因此PR是黃體生成激素(LH)依賴排卵所必需，而非顆粒細胞化成黃體所必備。ADAMTS－l是孕激素誘導(dǎo)排卵的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，用超排卵劑量的GnRH刺激PRAKO、PRBKO、PRKO的小鼠，與野生型的小鼠比，PRAKO小鼠的超排卵嚴重受損，但被孕激素誘導(dǎo)的ADAMTS－1和組織蛋白酶L(cathepsin－L)并未受損;PRBKO小鼠的促超排卵無影響;PRKO小鼠的促超排卵和孕激素誘導(dǎo)的成熟卵泡的壁層顆粒細胞上的ADAMTS－l和cathepsin－L被完全抑制［14］。這說明PRA的表達是排卵所必需的，PRB可能調(diào)節(jié)卵泡破裂的信號傳導(dǎo)通路，但這種機制尚未完全闡明。PRA/PRB與LH對排卵前的卵泡顆粒細胞的ADAMTS－l基因的反式激活起到協(xié)同作用，成為該基因誘導(dǎo)性的輔助調(diào)節(jié)子。對豬的卵丘－卵復(fù)合物(COCs)的研究表明，用FSH和LH作用于COCs，8h后卵丘上的PRB達高峰，20 h后PRA達高峰，PRA、PRB時空變化可影響卵丘細胞的增大和卵母細胞重新啟動第二次減數(shù)分裂［15］。張鴻波等［16］研究發(fā)現(xiàn)PR不僅受P4的調(diào)節(jié)，而且受E2的調(diào)節(jié)。

本實驗用ELISA檢測被動吸煙大鼠與空白對照組大鼠血清中孕激素水平的改變，結(jié)果顯示被動吸煙組大鼠血清孕激素均比空白對照組明顯降低;用免疫組化方法檢測被動吸煙大鼠與空白對照組大鼠卵巢中PR的表達，結(jié)果顯示被動吸煙組大鼠PR的表達顯著低于空白對照組，提示被動吸煙可引起血清中P4含量的減少，也可引起卵巢PR的表達減少。

(本文圖1～4見彩插6。)

［1］Bordel R，Laschke MW，Menger MD，et al.Nicotine does not affect vascularization but inhibits growth of freely transplanted ovarian follicles by inducing granulosa cell apoptosis［J］. Human Reprod，2006，21(3):610－617.

［2］蔣利華，姚珍薇，張新華.吸煙與卵巢早衰關(guān)系的探討［J］.中國醫(yī)學(xué)理論與實踐，2006，16(2):250－252.

［3］Cooper GS，Baird DD，Hulka BS，et al.Follicle－stimulating hormone concentrations in relation to active and passive smoking［J］.Obstet Gynecol，1995，85(3):407－411.

［4］徐凌，蔡柏薔，朱元玨，等.N－乙酰半胱氨酸對大鼠慢性阻塞性肺疾病模型細胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的影響［J］.中華內(nèi)科雜志，2004，43(8):595－599.

［5］李麗斐，張學(xué)紅.卵泡液TGF－α與雌孕激素調(diào)節(jié)在卵泡發(fā)育中的作用［J］.生殖與避孕，2007，27(5):360－362，366.

［6］王小青，郭述真.生殖系統(tǒng)雌激素受體的研究進展［J］.國外醫(yī)學(xué)婦產(chǎn)科學(xué)分冊，2005，32(2):75－77.

［7］M lynarcikova A，F(xiàn)ickova M，Scsukova S.Ovarian intrafollicular processes as a target for cigarette smoke components and selected environmental reproductive disruptors［J］.Endocr Requl，2005，39(1):21－32.

［8］Chen C，Wang X，Wang L，et al.Effect of environmental tobacco smoke on levels of urinary hormone markers［J］.Environ Health Perspect，2005，113(4):412－417.

［9］Flouris AD，Metsios GS，Jamurtas AZ，et al.Sexual dimorphism in the acute effects of second hand smoke on thyroid hormone secretion，inflammatory markers and vascular function［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2008，294(2):E456－E462.

［10］Vidal JD，VandeVoort CA，Marcus CB，et al.In vitro exposure to environmental tobacco smoke induces CYP1B1 expression in human luteinized granulosa cells［J］.Reprod Toxicol，2006，22 (4):731－737.

［11］Gava N，Clarke CL，Byth K，et al.Expression of progesterone receptors A and B in the mouse ovary during the estrous cycle［J］.Endocrinology，2004，145(7):3487－3494.

［12］王育華，趙晶.女性生殖系統(tǒng)激素受體的分布及特征［J］.中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2001，44(4):433－436.

［13］Robker RL，Russell DL，Espey LL.Progesterone－regulated genes in the ovulation process:ADAMTS－l and cathepsinK L proteases［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97(9):4689－4694.

［14］Shindo T，Kurihara H，Kuno K，et a1.ADAMTS－l:a metalloproteinase－disintegrin essential for normal growth，fertility，and organ morphology and function［J］.J Clin Invest，2000，105(10):l345－l352.

［15］Shimada M，Yamashita Y，Ito J，et a1.Expression of two progesterone receptor isoforms in cumulus cells and their roles during meiotic resumption of porcine oocytes［J］.J Mol Endocrinol，2004，33(1):209－225.

［16］張鴻波，秦國嵩，劉云海，等.雌激素和孕激素對不同發(fā)情方式小鼠子宮內(nèi)膜中孕激素受體分布的影響［J］.中國實驗動物學(xué)報，2009，17(3):206－209.

Effects of Passive Sm oking on Rat Ovarian Estrogen and Progesterone and Their Recep tors

YIN Chong－gao1，LI Ruo－bao2，LI Hong－li3，YANG Xiao1
(1.School of Nursing，2.Department of Anatomy，3.Medical Experiment Center，Weifang Medical College，Weifang 261053，China)

ObjectiveThe aim of this study was to observe the effects of passive smoking on ovarian structure in Wistar rats and detect reproductive hormone levels to analyze the changes in reproductive endocrinology，and provide further theoretical and experimental evidence for promoting reproductive age women to avoid passive smoking.M ethods Thirty two healthy female W istar rats，200－250 g weight，were random ly divided into control and smoking groups(n=16).The control rats fed normally and the experimental rats smoked for 3 months.All rats were killed at 3 months after the experiment.The serum E2and P4levels were measured by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The expressions of ER and PR were assessed by immunohistochemistry.The data were analyzed with SPSS 11.5 for W indows.Results①The ELISA showed that the serum levels of both estrogen and progesterone were significantly lower in the smoking rats than those in non－smoking rats(both P＜0.05).②Immunohistochemical results showed that ER positive material was mainly distributed in the cell nuclei of the rat ovarian granulosa cells.The ER expression level was significantly lower in theovaries of smoking rats than that in the control group(P＜0.01).PR positive material mainly was distributed in the cytoplasm and cell nucleus of the rat ovarian granulosa cells.The level of PR expression was significantly lower in the ovaries of smoking rats than that in the control group(P＜0.01).Conlusion①A rat model of passive smoking has been successfully established.②Passive smoking can decrease the serum levels of E2and P4in rats and the expression of ER and PR in rat ovaries.Passive smoking can harm ovarian function and cause reproductive endocrine disorders.

Passive smoking;Ovary;Estrogen;Progesterone;ER;PR;Rats

Q954.62

A

1005－4847(2010)04－0331－05

2009－11－29

山東省衛(wèi)生廳資助項目(編號:2007HZ021)

尹崇高(1979－)，男，講師，主要從事臨床外科。

李若葆，濰坊醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，副教授，碩士生導(dǎo)師，E－mail:lirb@w fmc.edu.cn