吳劍平，楊斐，胡櫻

(復旦大學實驗動物科學部，上海 200032)

研究報告

常規(guī)實驗操作對Wistar大鼠的影響

吳劍平，楊斐，胡櫻

(復旦大學實驗動物科學部，上海 200032)

目的常規(guī)實驗操作對W istar大鼠的影響。方法采用W istar大鼠，分別進行腹腔注射、肌內注射、灌胃、尾靜脈切割采血、剪尾采血和固定操作，連續(xù)處理7 d后，測定各組大鼠神經內分泌、免疫、血液系統(tǒng)主要指標及肝臟hsp72 mRNA表達量，并與對照組比較，分析這些操作的影響。結果與對照組相比，腹腔注射組、肌內注射組和灌胃組的皮質酮(CORT)、γ－干擾素(IFN－γ)、γ－干擾素/白介素－4(IFN－γ/IL－4)比值極顯著升高，白細胞總數(shù)(WBC)、中性粒細胞比例(WLCR)、C－反應蛋白(CRP)、β－內啡肽(β－EP)及白介素－2(IL－2)有不同程度的顯著降低。與對照組相比，尾靜脈切割采血組的CORT、IFN－γ、IFN－γ/IL－4比值極顯著升高，WBC、β－EP有不同程度的顯著降低;剪尾采血組的CORT、IFN－γ、IFN－γ/IL－4比值有不同程度的顯著升高，β－EP、IL－2、CRP極顯著降低;固定組的CORT、IFN－γ/IL－4比值、IL－2、CRP極顯著升高，WBC、β－EP、IL－4有不同程度的顯著降低。與對照組相比，所有實驗操作均使熱休克蛋白(HSP)hsp72 mRNA表達極顯著升高。此外，與對照組相比，肌內注射組的紅細胞數(shù)(RBC)和血紅蛋白含量(HGB)顯著升高，尾靜脈切割和剪尾采血組的HGB和紅細胞壓積(HCT)極顯著降低，固定組的RBC、HGB和HCT均極顯著升高。結論本研究中涉及的常規(guī)實驗操作均引起了大鼠極顯著的應激反應，并造成了大鼠神經內分泌系統(tǒng)的紊亂及免疫功能的抑制，從而對動物造成了惡性應激。同時這些操作可能會對涉及的神經內分泌及血液學指標的相關研究產生背景性干擾。

W istar大鼠;常規(guī)實驗操作;神經內分泌;免疫;背景性干擾

動物實驗中，經常要對動物進行各種常規(guī)實驗操作(如給藥、采血等)。這些常規(guī)實驗操作對動物來說也是一種應激［1］，因此可能會對動物的健康和福利產生不利影響，甚至會干擾科學研究的結果。Gartner等［2］的研究證明僅在實驗室里對大鼠進行短距離的搬動即會造成其心率、皮質酮等多項指標的顯著變化。我們之前的實驗也曾研究證明短途運輸會顯著影響大鼠的代謝、神經內分泌及免疫功能［3］。可見實驗動物很容易受到各種常規(guī)實驗處理的影響，導致其生理平衡的紊亂。因此，確切地評價常規(guī)實驗操作對動物的影響是很有必要的。但在國內外，有關各種具體實驗操作對動物的影響研究仍然較少見。根據這一情況，本實驗選取給藥、采血和固定這幾種動物實驗中最常用到的操作，觀察這些操作本身對W istar大鼠神經內分泌、免疫及血液學主要指標的影響，并分析這些指標的變化對大鼠的影響及對動物實驗研究可能會造成的背景性干擾。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級近交系雄性W istar大鼠80只，體質量(200±10)g，由中國科學院上海實驗動物中心提供［SCXK(滬)2007－0005］。

1.2 儀器設備

Bio－Tek Elx800 USA酶標儀(美國)，pocH－100iv Diff全自動動物血液分析儀(日本)，ABI7300熒光定量PCR儀(美國)。

1.3 主要試劑

大鼠血清皮質酮(CORT)、β－內啡肽(β－EP)、C－反應蛋白(CRP)、γ－干擾素(IFN－γ)、白介素－2(IL－2)、白介素－4(IL－4)測定試劑盒為美國RB公司產品。M－MLV、M－MLV 5×reaction buffer，Recombinant RNAsin系Promega公司產品。dNTPmix，F(xiàn)Q－PCR Premix Kit為Transhold公司產品。Trizol試劑、Oligo dT18和引物為Invitrogen公司產品。各引物5＇－3＇的序列分別為:

hsp72(上游):5′－TTTCTGGCTCTCAGGGTGTT－3′;

hsp72(下游):5′－CTGTACACAGGGTGGCAGTG－3′;

β－actin(上游):5′－CCTCTATGCCAACACAGT－3′;

β－actin(下游):5′－AGCCACCAATCCACACAG－3′。

1.4 飼養(yǎng)條件

W istar大鼠飼養(yǎng)在我部屏障環(huán)境［SYXK(滬) 2007－0002］中，根據國標GB14925－2001的要求，控制有關環(huán)境參數(shù)，并先給予3d的健康適應期，自由飲食。

1.5 分組處理與指標測定

1.5.1 實驗A:測定三種給藥方式對大鼠的影響，共分4組，即A1組、A2組、A3組和AC組，每組10只動物。具體實驗處理如下:①A1組:腹腔注射生理鹽水，2次/日，每次1 m L，操作時間分別為am 9:00～10:00，pm15:00～16:00。②A2組:肌內注射生理鹽水，2次/日，每次0.02 m L，處理時間同A1組。③A3組:生理鹽水灌胃，2次/日，每次1 m L，處理時間同A1組。④AC組:為空白對照，常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何實驗處理。所有實驗組非實驗處理時間的飼養(yǎng)管理與對照組一致。各實驗組均連續(xù)處理7d。對照組和所有實驗組最后一次實驗處理結束后15 m in，從尾靜脈切割采血，用于血常規(guī)的測定，從心臟采血用于激素、免疫因子和CRP的測定。之后動物頸椎脫臼處死，并采集肝臟組織用于hsp72轉錄水平的測定。指標測定方法:外周血血常規(guī)由自動血球儀測定，激素、免疫因子及CRP的測定均采用ELISA法。hsp72轉錄水平的測定采用實時熒光定量PCR法，以RATβ－actin為內參，采用2－ΔΔct法對hsp72表達相對定量。

1.5.2 實驗B:測定兩種采血和固定操作對大鼠的影響，共分4組，即B1組、B2組、B3組和BC組，每組10只動物。具體實驗處理如下:①B1組:第1天處理從距大鼠尾尖3 cm左右的一側尾靜脈做一小切口，采血40 μL，用無菌干棉球輕微按壓止血。以后1次/日，后1 d采血部位選擇大鼠另一側尾靜脈，切口從尾尖到尾根逐次向上，相鄰切口間隔2 mm左右，采血量均為40 μL。每天處理時間均為am9:00～10:00。②B2組:剪尾采血，從大鼠尾尖到尾根部逐次向上，每次剪去大鼠尾尖2 mm左右，采血量均為40 μL，1次/日，處理時間同B1組。③B3組:將大鼠固定在常規(guī)大鼠固定器中，每次固定15min，2次/日，處理時間分別為am9:00～10:00，pm15:00～16:00。④BC組:為空白對照，常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何實驗處理。所有實驗組非處理時間的飼養(yǎng)管理與對照組一致。各實驗組均連續(xù)處理7d，采樣和各指標測定同實驗A。

1.6 統(tǒng)計學處理

結果以均值±標準差表示，應用STATA軟件進行統(tǒng)計分析，采用one way ANOVA和Bonferroni法檢驗組間差異，檢驗水準α=0.05，α=0.01。

2 結果

2.1 實驗A結果

2.1.1 各組血常規(guī)指標測定結果:見表1。WBC測定顯示，與AC組相比，A1、A3組均顯著降低(P＜0.05)，A2組極顯著降低(P＜0.01);RBC測定顯示，與AC組相比，A2組有顯著性升高(P＜0.05); HGB測定顯示，與AC組相比，A2組有顯著性升高(P＜0.05);WSCR測定顯示，與AC組相比，A1組極顯著升高(P＜0.01)，A2組有顯著性升高(P＜0.05);WLCR測定顯示，與AC組相比，各實驗組均有顯著性降低(P＜0.01)。

2.1.2 各組β－EP、CORT、IFN－γ、IL－4、IL－2、IFN－γ/ IL－4及CRP的測定結果:見表2。CORT測定顯示，與AC組相比，A1組和A3組均極顯著升高(P＜0.01)，A2組有顯著性升高(P＜0.05);IFN－γ和IFN－γ/IL－4測定顯示，與AC組相比，各實驗組均極顯著升高(P＜0.01);β－EP、IL－2和CRP測定顯示，與AC組相比，各實驗組均降低且差異有顯著性(P＜0.01)。

表1 各組血常規(guī)的測定結果(n=10)Tab.1 Results of routine blood tests(n=10)

表2 各組CORT、β－EP、IFN－γ、IL－4、IL－2、IFN－γ/IL－4及CRP的測定結果(n=10)Tab.2 Results of measurements of CORT，β－EP，IFN－γ，IL－4，IL－2，IFN－γ/IL－4 and CRP(n=10)

2.1.3 各組hsp72 mRNA表達的測定結果:見圖1。各實驗組hsp72 mRNA的表達量經β－actin校正后，均用相對于對照組的倍數(shù)值表示。如圖1所示，與AC組相比，各實驗組大鼠肝臟的hsp72 mRNA表達均有顯著性升高(P＜0.01)。

2.2 實驗B結果

2.2.1 各組血常規(guī)指標測定結果:見表3。WBC測定顯示，與BC組相比，B1、B3組均降低且差異有顯著性(P＜0.01);RBC的測定顯示，與BC組相比，B3組升高且差異有顯著性(P＜0.01);HGB測定顯示，與BC組相比，B1、B2組均降低，B3組升高，差異均有顯著性(P＜0.01);HCT測定顯示，與BC組相比，B1、B2組均降低，B3組升高，差異均有顯著性(P＜0.01);WSCR測定顯示，與BC組相比，B1組有顯著性降低(P＜0.05)，B2組有極顯著性降低(P＜0.01);WLCR測定顯示，與BC組相比，B2組有顯著性升高(P＜0.05)。

注:與AC組比較，**P＜0.01。圖1實驗A hsp72mRNA相對表達量測定結果Note:compared with group AC，**P＜0.01Fig.1 Experiment A，the results of measurements of the relative hsp72 mRNA expression

表3 各組血常規(guī)的測定結果(n=10)Tab.3 Measurements of routine blood tests in the rats(n=10)

2.2.2 各組CORT、β－EP、IFN－γ、IL－4、IL－2、IFN－γ/ IL－4及CRP的測定結果:見表4。CORT測定顯示，與BC相比，B1、B2和B3組均極顯著升高(P＜0.01);β－EP測定顯示，與BC組相比，B1、B2組均有顯著性降低(P＜0.05)，B3組極顯著降低(P＜0.01);IFN－γ測定顯示，與BC組相比，B1、B2組均極顯著升高(P＜0.01);IL－4測定顯示，與BC組相比，B3組降低且差異有顯著性(P＜0.05);IFN－γ/ IL－4比值測定顯示，與BC組相比，B1、B2和B3組均有顯著性升高(P＜0.01);IL－2測定顯示，與BC組相比，B2組降低，B3組升高，差異均有顯著性(P＜0.01);CRP測定顯示，與BC組相比，B2組降低，B3組升高，差異均有顯著性(P＜0.01)。

表4 各組CORT、β－EP、IFN－γ、IL－4、IL－2、IFN－γ/IL－4及CRP的測定結果(n=10)Tab.4 Results of measurements of CORT，β－EP，IFN－γ，IL－4，IL－2，IFN－γ/IL－4 and CRP(n=10)

2.2.3 各組hsp72mRNA表達的測定結果:見圖2。

各實驗組hsp72 mRNA的表達量經β－actin校正后，均用相對于對照組的倍數(shù)值表示。如圖2所示，相對BC組各實驗組大鼠肝臟的hsp72 mRNA表達均有顯著性升高(P＜0.01)。

注:與BC組比較，**P＜0.01。圖2實驗B hsp72 mRNA相對表達量測定結果Note:compared with group BC，**P＜0.01Fig.2 Expermen B，the results of measurements of the relative hsp72 mRNA expression

3 討論

給藥、采血和固定操作對大鼠是一種身心復合應激，不僅會引起動物的疼痛或不適，還會造成動物心理上的緊張和反抗情緒。應激反應的基礎是體內一系列神經內分泌免疫網絡系統(tǒng)的相互作用。機體在應對應激時，會引起下丘腦－垂體－腎上腺皮質軸(HPA軸)的興奮，使多種神經內分泌因子的水平發(fā)生變化，進而對機體的免疫、血液等其他各個系統(tǒng)的功能進行調節(jié)［4］。因此，本實驗即從測定這些操作應激所造成的動物神經內分泌、免疫和血液系統(tǒng)主要指標的變化出發(fā)，探討常規(guī)實驗操作對大鼠的影響。

應激可誘導機體熱休克蛋白(HSP)的大量表達，其中以HSP70家族最保守且最重要，其具有廣泛的細胞保護、分子伴侶、免疫等生物學功能［5］。研究表明，HSP70家族中的hsp72在應激反應中可迅速誘導表達，對多種應激源的反應更敏感，其表達水平可反映機體應激反應的程度［6］。研究結果顯示，各種操作均引起了大鼠hsp72的大量表達。表明這些操作對大鼠造成的應激強度均很大，使大鼠體內發(fā)生了極顯著的應激反應，且hsp72的大量表達有助于大鼠應激損傷的修復。

糖皮質激素(GC)為HPA軸的終末效應激素，可反映HPA軸的激活程度。研究表明，急性應激會引起HPA的興奮及GC水平的升高;而同種應激源的長時間反復應激后，機體HPA軸可出現(xiàn)適應性反應，再次應激時GC水平不再升高［7］。本研究中，連續(xù)7 d對大鼠進行常規(guī)實驗操作后，各操作組大鼠的CORT仍明顯升高。表明大鼠在短時間內并不能適應這些操作應激，HPA軸仍處于明顯興奮狀態(tài)。應激時HPA軸的適度興奮是維持機體穩(wěn)態(tài)的必要條件，然而HPA軸的長時間過度興奮尤其是糖皮質激素(GC)的大量分泌，則會導致機體內環(huán)境的紊亂及免疫功能的抑制等而損害機體的健康。β－EP為應激反應中重要的神經遞質，對神經內分泌和免疫系統(tǒng)具有雙重調節(jié)作用。通常在應激狀態(tài)下，內源性阿片肽可抑制機體HPA軸功能，在控制應激激素分泌中起著“負調節(jié)作用”，由此來削弱由過度刺激引起的傷害性后果［8］。本研究中，各實驗組大鼠β－EP水平較對照組均有不同程度的顯著降低。提示這些操作應激造成了大鼠神經內分泌負反饋調節(jié)平衡的紊亂，推測這可能是HPA軸出現(xiàn)持續(xù)興奮的重要原因之一。據報道，β－EP還具有促進IL－1、IL－2的表達等多種免疫功能，且是最有效的內源性鎮(zhèn)痛物質之一［3］。因此，β－EP水平的降低可能會對大鼠的免疫功能產生不利影響，同時可能會導致大鼠對疼痛的耐受性下降而影響動物的福利水平。

外周血WBC、WSLR和WSCR可反映機體整體免疫功能狀況和外周免疫監(jiān)視能力。IL－2是介導T細胞活化增殖必需的細胞因子，并能增強NK和CTL細胞的活性等［9］，因此常作為反映機體免疫功能的重要指標。本研究顯示，腹腔注射、肌內注射和灌胃操作組大鼠的外周血WBC總數(shù)、WLCR及IL－2，以及尾靜脈切割采血組的外周血WBC總數(shù)和WSCR、剪尾采血組的IL－2和WSCR、固定組的外周血WBC總數(shù)較對照組均有不同程度的顯著降低。可見各種操作應激均已造成大鼠免疫功能不同程度的抑制。機體內IFN－γ和IL－4可分別誘導Th0向Th1和Th2分化，故其比值可反映Th1/Th2平衡的變化。Th1/Th2的平衡是維持機體正常免疫功能的必要條件［9］。本研究中，各操作組大鼠的IFN－γ/IL－4比值均出現(xiàn)明顯降低。除固定組主要由IL－4水平的降低所致外，其他各實驗組均由IFN－γ的顯著升高所致。表明這些操作應激造成了大鼠Th1/Th2平衡的失調，出現(xiàn)Th1優(yōu)勢狀態(tài)。大鼠免疫功能的抑制及Th1/Th2平衡的失調均會增加其對病原體及相關疾病的易感性。

本研究還觀察了一種重要的急性期反應蛋白—CRP的水平。研究發(fā)現(xiàn)，固定組的CRP水平較對照組顯著升高，而腹腔注射、肌內注射、灌胃和剪尾采血組CRP水平較對照組顯著降低。這提示在不同的應激反應中CRP水平會有不同的變化，其變化的方向可能由不同應激源本身的性質所決定。相關資料報道，CRP為心血管疾病、糖尿病等的危險因子，其水平的升高會增加機體對這些疾病的易感性［11］。此外，CRP還具有重要的免疫功能，如激活補體、調理吞噬作用、促進細胞因子的表達等［12］。因此，其水平的降低可能也參與介導了大鼠免疫功能的抑制。

研究顯示，肌內注射操作還引起了大鼠RBC和HGB的升高，固定操作組大鼠的RBC、HGB和HCT三項指標均升高，而兩種采血操作卻降低了大鼠HGB和HCT的水平。有關這幾組大鼠血液學指標變化的原因尚不明確，其機制有待進一步研究。但在動物實驗中，這些操作引起的大鼠血液學指標的變化，以及所有操作對大鼠神經內分泌及免疫學指標的影響，則均可能會對有關這些指標的實驗研究產生背景性干擾，從而影響研究結果的可靠性。因此，研究者應考慮到各種常規(guī)操作對實驗結果影響的可能性。為減少這種操作應激的背景性干擾，研究中可選擇對動物影響相對較小的實驗操作。如有關資料表明，剪尾采得的血液相對尾靜脈切割更易出現(xiàn)溶血現(xiàn)象［13］。本研究中，剪尾采血對大鼠各項指標的影響也表現(xiàn)出更為顯著的趨勢，且剪尾本身對動物的福利損害相對也更明顯。因此，動物實驗中建議選擇尾靜脈切割采血作為獲取大鼠微量血樣的“優(yōu)化”方法。

應激反應中，適度的良性應激有助于提高機體的抵抗力，但應激強度過大或惡性應激則會造成機體各系統(tǒng)功能的紊亂，使機體處于亞健康或亞病理狀態(tài)。本研究揭示了常規(guī)實驗操作對大鼠生理功能的影響，由于不同性質的應激源對機體作用機制的不同［14］，因此各種操作應激對大鼠各系統(tǒng)指標的影響不完全一致，但總體上均對大鼠造成了強烈的應激，大鼠神經內分泌系統(tǒng)出現(xiàn)嚴重紊亂，免疫功能明顯受抑，從而使大鼠的健康受到潛在威脅，表明這些操作均已對大鼠構成惡性應激。由此可見，常規(guī)實驗操作對動物的影響值得關注，評價各種操作對動物的影響，將有助于在動物實驗中控制這些操作應激對動物健康福利的損害，且有利于研究者更好地控制各項非實驗因素對動物實驗研究的干擾，提高研究結果的可靠性。

［1］Balcombe JP，Barnard ND，Sandusky C.Laboratory routines cause animal stress［J］.Lab Animal Sci，2004，43(6):42－51.

［2］Gartner K，Buttner D，Dohler K，et al.Stress response of rats to handling and experimental procedure［J］.Lab Animals，1980，14:267－274.

［3］楊斐，胡櫻.短途運輸應激對W istar大鼠的影響［J］.中國實驗動物學報，2009，17:38－43.

［4］金惠銘，王建枝.病理生理學［M］.第六版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2004，144－151.

［5］林鐘婷，朱靜，翁銀標，等.熱休克蛋白70的研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2007，34(3):67－70.

［6］Campisi J，Leem TH，F(xiàn)leshner M，et al.Stress－induced extracellular Hsp72 is a functionally significant danger signal to the immune system［J］.Cell Stress＆Chaperones，2003，8(3): 272－286.

［7］Garca A，Mart O，Vallès A，et al.Recovery of the hypothalamicpituitary－adrenal response to stress［J］.Neuroendocrinology. 2000，2:114–125.

［8］杜雨蒼.神經肽與腦功能［M］.上海:上?？萍冀逃霭嫔?，1998，151－171.

［9］光炎.免疫學原理［M］.第一版.上海:上海科學技術出版社，2007，87.

［10］姚金晶，陳宜濤.Th1/Th2平衡調節(jié)與疾病發(fā)生的研究進展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2009，9:2597－2600.

［11］王一丹，楊萬松.CRP與代謝綜合癥［J］.實用心腦肺血管病雜志，2007，15:482－485.

［12］Black S，Kushner I，Samols D.C－reactive protein［J］.J Biol Chem.2004，279:48487－48490.

［13］Christensen SD，Mikkelsen LF，F(xiàn)els JJ，et al.Quality of plasma sampled by different methods for multiple blood sampling in mice［J］.Lab Anima，2009，43:65－71.

［14］Bowers SL，Bilbo SD，Dhabhar FS，et al.Stressor－specific alterations in corticosterone and immune responses in mice［J］. Brain Behav Immunity，2008，22:105－113.

Negative Im pact of Routine Experim ental Procedures on W istar Rats

WU Jian－ping，YANG Fei，HU Ying
(Department of Laboratory Animal Science，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China)

Objective To study the influence of routine experimental procedures on Wistar rats.M ethods Intraperitoneal injection(ip)，intramuscular injections(im)，intragastric injection(ig)，blood sampling by tail vein incision(tv)，blood sampling by tail tip cutting(tc)and restraint procedures were selected in this experiment.Each procedure was respectively done on W istar rats.After continuously hand led for seven days，the main neuroendocrine，immune and haematological indexes were measured to study the effects of these procedures on the rats.ResultsCompared with the control group，CORT，IFN－γ，IFN－γ/IL－4 were significantly increased and WBC，WLCR，CRP，β－EP，IL－2 were significantly decreased in the ip，im and ig groups.Compared with the control group，CORT，IFN－γ，IFN－γ/IL－4 were significantly increased and WBC，β－EP were significantly decreased in the tv group;CORT，IFN－γ，IFN－γ/IL－4 were significantly increased and β－EP，IL－2，CRP significantly decreased in the tc group;CORT，IFN－γ/IL－4，IL－2，CRP significantly increased，and WBC，β－EP，IL－4 significantly decreased in the restraint group.Hsp72 mRNA was significantly increased in all the experimental groups.Furthermore，compared with the control group，RBC and HGB were significantly increased in the im group，HGB and HCT significantly decreased in the tv and tc groups，RBC，and HGT and HCT significantly increased in the restraint group.ConlusionRoutine experimental procedures cause severely stress reactions，and lead to neuroendocrine dysfunction and immunosuppression in rats.It is of importance that those stress conditions may lead to considerable background－interference on some experimental neuroendocrine，immunological andhaematological researches.

W istar rat;Routine experimental procedures;Neuroendocrine;Immunity;Background－interference

Q－95

A

1005－4847(2010)04－0312－06

2009－11－18

上海市科技發(fā)展基金項目(編號:071409008)。

吳劍平(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:比較醫(yī)學與實驗動物應用。E－mail:w jp4411544@163.com

楊斐，男，副研究員，碩士生導師，主要從事實驗動物學教學、科研和管理。E－mail:yfdwbfd@fudan.edu.cn