范薇，隋麗華，劉大偉，趙爽，張慧洋，趙源，汪舟佳，劉永梅

(1.軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，北京 100071;2.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院禽病防治研究中心，雅安 625014; 3.軍事醫(yī)學科學院疾病預防控制所，北京 100071)

研究報告

實驗動物CAR桿菌16SrRNA基因PCR監(jiān)測方法的建立

范薇1，2，隋麗華1，劉大偉3，趙爽1，張慧洋1，趙源1，汪舟佳3，劉永梅1

(1.軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，北京 100071;2.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院禽病防治研究中心，雅安 625014; 3.軍事醫(yī)學科學院疾病預防控制所，北京 100071)

目的建立CAR桿菌的PCR監(jiān)測方法，篩查國內部分實驗動物樣本中CAR桿菌攜帶狀況。方法利用CAR桿菌的特有16SrRNA基因序列片段267bp設計引物，通過從日本實驗動物中央研究所獲取的CAR標準株DNA，建立實驗動物CAR桿菌16SrRNA基因PCR監(jiān)測方法。結果利用建立的CAR桿菌16SrRNA基因PCR監(jiān)測方法對國內455份實驗動物樣本進行篩查，未檢出CAR桿菌感染。結論建立了敏感性好，特異性高的實驗動物CAR桿菌PCR監(jiān)測方法，未見動物攜帶CAR桿菌。

實驗動物;CAR桿菌;16S rRNA;PCR

CAR桿菌(cilia－associated respiratory bacillus)是目前尚未分類的、一種實驗嚙齒類和兔類的呼吸道感染細菌?！癈AR”由Ganaway1985年首次提出并使用，因該細菌未被分類鑒定并命名，所以一直沿用至今［1］。近年來各種呼吸道疾病的暴發(fā)，人們開始對各種呼吸道傳染性疾病病原的相關研究給予足夠的重視，各種實驗動物被用于呼吸道疾病，特別是傳染性疾病的模型研究之中。CAR桿菌可以導致無癥狀的慢性呼吸道疾病，嚴重影響用于呼吸道相關疾病研究的動物實驗結果。歐美許多國家和企業(yè)都將其列為實驗動物必需排除的病原菌之一。目前我國尚未將CAR桿菌列為實驗動物必需檢測的項目，對該菌的研究處于一個基本空白的狀態(tài)，缺乏病原學、流行病學的相關資料以及有效的檢測方法［2］。

為了解我國CAR桿菌流行情況，建立相關的快速檢測方法，本研究擬利用CAR桿菌特有的16SrRNA基因序列片段，建立CAR桿菌的PCR監(jiān)測方法，并對國內455份實驗動物標本進行了篩查，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株:陽性對照CAR桿菌小鼠株DNACARM由日本實驗動物中央研究所伊藤豐志雄教授惠贈。E.coli DH5α由本室保存，pGEM－T克隆載體為Promega公司產品。

1.1.2 工具酶、試劑和抗體:各種限制性內切酶、PCR試劑為TaKaRa公司(大連寶生生物工程有限公司)產品;T4DNA連接酶、質粒提取試劑盒為Promega公司(美國)產品;DNA提取試劑盒、DNA片段純化回收試劑盒為Qiagen公司(德國)產品。

1.1.3 引物設計:針對CAR桿菌保守的特有16SrRNA基因序列片段267 bp設計了兩條引物: P1:5′－TTA AAG CTC CGG CGC TCG AAG－3′;P2:5′－ACA CCC TTA GAA AAG GGG ATT－3′。

1.1.4 實驗動物:①北京市內多家實驗動物生產廠家(均持有北京市實驗動物生產許可證)提供的清潔級、SPF級大鼠200只，體質量180～220 g;清潔級、SPF級小鼠200只，體質量18～22 g，來源同上。②小型豬25只，由中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所［SYXK(京)2008－0007］提供，均為3～6月齡，雄性15只，雌性10只。其中五指山小型豬為近交系動物，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境5只，飼養(yǎng)于普通環(huán)境5只;廣西巴馬小型豬為封閉群動物，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境5只，飼養(yǎng)于普通環(huán)境5只;貴州小型豬為封閉群動物，飼養(yǎng)于普通環(huán)境5只。③恒河猴30只，軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供【SCXK－(軍)2007－004】。為患病安樂死的動物，雌性14只，雄性16只，年齡在6月齡～2歲之間。

1.1.5 樣本采集:無菌打開動物胸腔，取氣管與肺相連的一段組織，－70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA制備:將肺組織快速解凍，用玻璃勻漿器將組織用PBS進行勻漿處理，用Qiagen組織DNA提取試劑盒提取DNA，用于PCR擴增。

1.2.2 PCR擴增:以提取的DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為50 μL。PCR反應參數(shù)為: 94℃3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃40 s，35個循環(huán)，72℃延伸7m in。取PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓為85 V。

1.2.3 序列測定:將純化的DNA片段，直接連接pGEM－T克隆載體，轉化感受態(tài)E.coli DH5α，鋪于含IPTG和X－gal的LB平板上，挑取白色菌落進行PCR及酶切鑒定。陽性克隆使用ABI377全自動測序儀(上海生物工程有限公司)以通用引物(T7，SP6)對插入片段進行序列測定。

1.2.4 DNA提取方法驗證:將標準DNA 10 μL加入到已經確認為陰性的組織勻漿中，同時與未加陽性DNA的樣本勻漿進行DNA提取后進行PCR擴增。

1.2.5 方法特異性驗證:將金黃色葡萄球菌，嗜肺巴斯德桿菌，大腸桿菌，綠膿桿菌常規(guī)方法液體培養(yǎng)后，將菌液100℃5min滅活，Qiagen DNA提取試劑盒提取DNA，與標準CAR桿菌DNA同時進行PCR擴增。

1.2.6 方法敏感性驗證:分別用陽性對照CAR桿菌DNA 2、1、0.5 μL為模板進行PCR擴增。

1.2.7 臨床標本普查:將提取的樣品DNA標本按照建立的方法條件進行PCR擴增。

2 結果

2.1 標準DNA樣本擴增結果

標準DNA樣本可見陽性267 bp條帶，見圖1。

M:2000 bp DNA marker;1:CAR桿菌。圖1 pcr擴增產物電泳圖M:2000 bp DNA marker;1:CAR bacillusFig.1 Electrophoretogram of the PCR amplification products

2.2 序列測定結果

經序列測定(圖2，彩插7)，插入片段與GenBank標準株序列同源性為100%(結果未顯示)。

2.3 DNA提取方法驗證結果

將標準DNA以同樣的方法提取后進行PCR擴增，結果標準DNA經DNA提取步驟后，仍可擴增出267 bp陽性條帶，陰性標本未見條帶，見圖3。

M:2000 bp DNA marker;1:CAR桿菌;2:陰性標本圖3 DNA提取方法驗證結果M:2000 bp DNA marker;1:CAR bacillus;2: Negative sampleFig.3 Validation of the isolation of CAR bacillus DNA

2.4 方法特異性驗證結果

金黃色葡萄球菌、嗜肺巴斯德桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌DNA均未擴增出陽性條帶，而CAR桿菌DNA可見陽性條帶，見圖4。

2.5 方法敏感性驗證實驗結果

幾個不同模板量均可擴增到267 bp的陽性條帶，見圖5。

2.6 動物樣本普查結果

普查實驗動物樣本455份，未見陽性結果。

3 討論

對CAR桿菌感染的診斷比較困難，診斷的方法包括血清學方法(ELISA、IFA)、PCR以及免疫組化和組織病理學方法。免疫組化和組織病理學只能在死亡的動物中進行。對組織切片進行顯微鏡觀察是CAR桿菌最特異的診斷方法，在肺組織中確證有該菌存在。確診的診斷標準是用W－S染色、銀染以及免疫組化等方法看到定植的組織切片中的纖絲狀細菌［1，3，4］。血清學實驗包括ELISA和IFA等是對CAR桿菌感染群進行最初監(jiān)測一種有效的方法。但是和很多細菌的血清學方法一樣，假陽性是不可避免的問題，因而陽性的結果必須使用其他確認病原體方法來驗證［5］。

M:1000 bp DNA marker;1:CAR桿菌;2:金黃色葡萄球菌;3:嗜肺巴斯德桿菌;4:大腸桿菌;5:綠膿桿菌圖4特異性實驗結果M:1000 bp DNA marker;1:CAR bacillus;2: Staphylococcus aureus;3:Pasteurella pneumotropica;4: Escherichia coli;5:Pseudomonas aeruginosaFig.4 Results of specificity test

M:1000 bp DNA marker;1:2 μL模板;2:1 μL模板; 3:0.5 μL模板圖5敏感性實驗結果M:1000 bp DNA marker;1:2 μL DNA temp late;2:1 μL template;3:0.5 μL DNA temp lateFig.5 Results of sensitivity test

目前常用病原學的檢測方法包括兩種:細菌分離培養(yǎng)和PCR擴增［6，7］。CAR桿菌不能在無細胞的培養(yǎng)基上生長，體外培養(yǎng)困難，目前國際上認可的方法包括:1985年Ganaway等報道的在雞胚尿囊膜上增殖培養(yǎng)該菌，1993年Schoeb建立了小鼠BALB/c3T3細胞培養(yǎng)的方法，以及使用SPF動物直接傳代的方法。這些方法都極易受到樣品中其他細菌的污染，導致培養(yǎng)失敗。PCR方法是針對CAR桿菌最迅速的一種診斷方法，可使用鼻拭子和呼吸道組織進行檢測。其相對簡單的操作方式可以用于日常的常規(guī)監(jiān)測［8］。由于目前我國沒有該菌的標準菌株，所以用PCR方法來進行篩查，是可操作性較強的監(jiān)測方式，一旦確定有陽性后可以進行后續(xù)的研究。

細菌核糖體16SRNA(16SrRNA)基因高度保守區(qū)為細菌共有，其基因序列的差異顯示了細菌種屬的差異。細菌核糖體16SRNA(16SrRNA)序列分析技術被廣泛應用于細菌的鑒定分型上。其優(yōu)點在于，該方法不依賴于細菌物的分離培養(yǎng)，是一種非培養(yǎng)分析技術，能夠快速鑒定那些目前尚不能人工培養(yǎng)或人工培養(yǎng)較為困難的細菌［9］。因此運用16S rRNA基因PCR方法來進行CAR桿菌檢測，可提供一種相對簡單和可操作性強的監(jiān)測方法。

本研究直接使用陽性DNA進行擴增。為了驗證普查所得出的陰性結果不是樣品DNA在提取過程中受到破壞所致，將標準DNA以同樣的方法提取后進行PCR擴增，結果顯示仍然能擴增出陽性條帶。證明提取DNA的方法不會對結果造成影響。

對所建立的方法進行了特異性和敏感性驗證，結果顯示特異性較好，其他細菌未擴增出相應條帶。敏感性顯示，使用0.5 μL標準樣品DNA仍可以擴增出陽性條帶。

篩查了國內清潔級，SPF級大鼠樣本200份，小鼠樣本200份，小型豬樣本25份，恒河猴樣本30份，均未普查到陽性結果，這對評價方法的有效性可能不是一個有力的佐證，但換言之也可能說明我國未有此種細菌感染。作為全國范圍內的流行病學調查來看，樣本數(shù)量還相對較少。另有資料報道，在兔類和其他動物中也發(fā)現(xiàn)有此菌的感染［10－12］，因此后續(xù)的工作中可擴大宿主的種類和進行大量的普查，以獲得更加精確的結果。

(本文圖2見彩插7。)

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Estab lishm ent of a PCR Assay for Detection of Cilia-Associated Respiratory Bacillus in Laboratory Anim als Based on 16SrRNA Gene Fragm ent Sequence

FAN Wei1，2，SUI Li－h(huán)ua1，LIU Da－wei3，ZHA0 Suang1，ZHANG Hui－yang1，ZHAO Yuan1，WANG Zou－jia3，LIU Yong－mei1
(1.Laboratory Animal Center，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China; 2.Research Center of Avian Diseases，College of Veterinary Medicine of Sichuan Agricultural University，Yaan 625014，China; 3.Institute of Disease Control and Prevention，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071)

Objective To establish a PCR assay for detection of cilia－associated respiratory bacillus，and to identify the infectious status of clinical samples from m ice，rats，mini pigs，rhesus monkeys，etc.M ethods The specific primers were designed according to the 267 bp 16SrRNA gene fragment sequence.Then the PCR assay was established by using DNA copy from Japan.ResultsFour hundred fifty five clinical samples were tested by this established method and no positive CAR bacillus infection was detected.ConlusionThe method established in this study is efficient with high sensitivity and specificity.The infection of CAR bacillus hasn’t been detected in laboratory animals in Beijing up to now.

Cilia－associated respiratory bacillus;16S rRNA;PCR;Laboratory animals

R332

A

1005－4847(2010)04－0308－04

2009－12－14

2004國家科技基礎條件平臺工作重點項目(課題號2003DIA7J033)。

范薇(1973－)，副研究員。目前從事實驗動物微生物研究。E－mail:fanwei@bmi.ac.cn