魏鎖成，鞏轉(zhuǎn)娣，韋敏，趙興緒

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州730070;2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030; 3.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，蘭州 730030)

研究報告

GnRH－A免疫與母兔生殖激素濃度的變化

魏鎖成1，2，鞏轉(zhuǎn)娣3，韋敏2，趙興緒1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州730070;2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030; 3.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，蘭州 730030)

目的探討促性腺激素釋放激素類似物(GnRH－A)對動物生殖功能調(diào)節(jié)的效果和作用機制。方法

24只日本大耳白兔分為四組，分別在實驗Ⅰ組(EG－I)、實驗Ⅱ組(EG－II)和實驗III(EG－III)組兔的頸背側(cè)注射1.0 m L(100、100和50 μg/m L)GnRH－A抗原，實驗II組和實驗III組于第3周以原劑量加強注射一次，用ELISA法測定血清GnRH抗體效價、促卵泡刺激素(FSH)和促黃體生成素(LH)含量。結(jié)果注射GnRH－A后10 d實驗組兔均出現(xiàn)GnRH抗體，而對照組未檢測到;EG－I在第30天達(dá)到高峰，而EG－II和EG－III于40～50 d至峰值，但在實驗結(jié)束時(70 d)實驗組均高于對照組，40～70 d時EG－II顯著高于EG－I和EG－III。30～50 d時EG－II的LH明顯高于EG－I和EG－III及對照組。EG－II和EG－III的FSH濃度在40 d達(dá)到峰值，但EG－II高于EG－I、對照組及EG－III，EG－I和對照組無顯著差異。結(jié)論兔體內(nèi)注射GnRH－A可以明顯提高GnRH抗體效價，增強LH和FSH的合成與分泌，加強注射效果更明顯，且與注射劑量相關(guān)，持續(xù)時間為40 d左右。

促性腺激素釋放激素類似物;促卵泡刺激素;促黃體生成素;母兔

促性腺激素釋放激素(GnRH)由丘腦下部釋放后與垂體前葉的促性腺激素分泌細(xì)胞(嗜堿性細(xì)胞)細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合，通過激活腺苷酸環(huán)化酶－cAMP－蛋白質(zhì)酶體系，促進促黃體生成素(LH)和促卵泡刺激素(FSH)的合成與釋放，但是，LH和FSH對GnRH的作用有所不同。促性腺激素釋放激素類似物(GnRH－A)是在天然的GnRH分子結(jié)構(gòu)上替換了第6、10位上的氨基酸所得，GnRH－A與GnRH具有十分相近的作用，然而，這種結(jié)構(gòu)的改變可減慢肽的降解，延長半衰期，使受體結(jié)合力增強100～200倍［1，2］。

Martemucci等［3］和Herman等均報道，GnRH主動免疫引起血漿LH水平急劇降低，而FSH只有輕度降低。有人給大鼠、兔、綿羊等動物快速靜脈注射GnRH及GnRH－A時，主要引起血漿LH水平明顯升高，但是用相同劑量的GnRH緩慢注射時，不但使LH水平升高，而且FSH水平也明顯升高。此外，近年來國內(nèi)外廣泛應(yīng)用GnRH及GnRH－A來提高家畜繁殖性能，取得了良好的效果，認(rèn)為GnRH及GnRH－A可誘發(fā)母畜排卵、提高受胎率。如配種前給母畜肌肉注射GnRH－A，可誘發(fā)母畜排卵，提高受胎率;分娩后早期用GnRH處理可加速牛的發(fā)情排卵、子宮復(fù)舊、縮短產(chǎn)犢間隔。Phatak等、馬玉林等［4］對羊的實驗表明，注射一定劑量的GnRH及類似物，能有效的提高其受胎率12%～15%。適量GnRH－A通過下丘腦－垂體－卵巢軸，引起垂體釋放LH和FSH［5］。因而，GnRH－A注射后對動物生殖功能與性腺激素的合成及分泌究竟有何作用? GnRH－A的注射劑量多少為宜?GnRH的抗體效價如何變化?作用的維持時間多長?下丘腦及垂體的組織結(jié)構(gòu)是否改變等等問題需進一步深入探討。為此，我們在前期研究的基礎(chǔ)上，對日本大耳白兔的GnRH－A進行了生殖免疫調(diào)節(jié)實驗研究，以期為科學(xué)應(yīng)用GnRH－A調(diào)控母畜的生殖機能提供依據(jù)，并探討GnRH－A的作用機制和臨床推廣價值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

GnRH－A，Zillion公司生產(chǎn)，純度(HPLC)≥98.99%;碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCL)，上海延長生化科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，純度(HPLC)≥99.23%;牛血清白蛋白(BSA)和弗氏不完全佐劑，美國Sigma公司生產(chǎn);二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔血清，博大泰克生產(chǎn);促卵泡激素檢測試劑盒(ELISA)、促黃體激素檢測試劑盒(ELISA)，北京北方生物技術(shù)研究所提供，96孔板。

1.2 主要儀器

TQ16－W型高速離心機(長沙湘儀)，透析帶(Solarbio公司)，96孔酶標(biāo)板(博大泰克)，Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(Thermo公司)，分析天平等。

1.3 實驗動物

3月齡健康日本大耳白兔(Oryctolagus cuniculus)24只，雌性，體質(zhì)量2.2～2.6 kg，購于蘭州生物制品研究所實驗動物中心(編號:2006－033)，隨機分為4組，實驗Ⅰ組(EG－I)、實驗II組(EG－II)、實驗Ⅲ組(EG－III)和空白對照組(CG)，每組6只。所用兔均分籠飼養(yǎng)，自由飲食。預(yù)飼10 d后進行正式實驗，按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.4 抗原制備

以碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCL)為偶合劑，將GnRH－A與牛血清白蛋白(BSA)連接為復(fù)合物，再加入弗氏不完全佐劑制成抗原乳劑。利用紫外吸收法求出GnRH－A的結(jié)合率為85%。并按參考文獻［6］進行無菌性、安全性和物理性狀檢驗。

1.5 免疫注射方法

在實驗Ⅰ組(EG－I)、實驗Ⅱ組(EG－II)、實驗Ⅲ組(EG－III)每只兔的頸背部皮下注射1.0 mL(100、100和50 μg/m L)GnRH－A抗原。EG－II和EG－III組于3周后分別用相同劑量與方法加強免疫一次。對照組(CG)不做任何處理。免疫注射當(dāng)天記為d0。

1.6 血樣采集

每只兔于注射GnRH－A抗原前1 d、注射后10、20、30、40、50、60和70 d分別從頸靜脈采血10 mL，采集的血液立即37℃水浴30 m in，2500～3000 r/ min離心10～12 m in，分離血清，－20℃保存。采血前禁食12 h。

1.7 檢測項目

1.7.1 GnRH抗體效價測定:用間接ELISA法測定［7］。

1.7.2 血清FSH和LH濃度測定:用血清促卵泡激素(FSH)診斷試劑盒和血清促黃體激素(LH)診斷試劑盒(ELISA法)測定。具體操作步驟如下:①設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔。每個標(biāo)準(zhǔn)品孔加入標(biāo)準(zhǔn)液50 μL，待測樣品孔加血清50 μL。②每孔加FITC標(biāo)記抗體50 μL，充分混勻，37℃孵育60 m in?？瞻卓撞患尤魏我后w。③棄去液體，每孔加洗滌液，靜置10 s，重復(fù)3次拍干。④每孔加入酶結(jié)合物，充分混勻，37℃孵育30 min。⑤加顯色劑A液和B液各50 μL，振蕩混勻，37℃避光顯色15 m in。⑥每孔加終止溶液50 μL。⑦用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的吸光度(A值)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

以Spss13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，t檢驗進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 抗原包被濃度及血清最佳工作濃度結(jié)果

當(dāng)抗原稀釋800倍和血清稀釋100倍時，其A490為0.987，最接近1，所以抗原最佳濃度為1∶800倍稀釋，血清的最佳濃度為1∶100倍稀釋［7］。

2.2 GnRH抗體效價見表1。

表1 血清GnRH抗體效價測定值(±s)Tab.1 Determination of serum GnRH antibody titer in the immunized rabbits(±s)

表1 血清GnRH抗體效價測定值(±s)Tab.1 Determination of serum GnRH antibody titer in the immunized rabbits(±s)

注:同一列中，標(biāo)肩字母相同表示差異無顯著性(P＞0.05);標(biāo)肩不同表示差異有顯著性(P＜0.05)，其中標(biāo)肩字母相連(如ab，bc等)表示差異有顯著性(P＜0.05)，標(biāo)肩字母間有間隔(如ac，bd等)表示差異有顯著性(P＜0.01)。下同。Notes:The same superscript letters in the same column mean that there was no significant difference(P＞0.05).The different superscript letters mean that there was a significant difference between groups，of which ad jacent superscripts(such as ab)indicate that the difference was significant(P＜0.05)，while interval superscripts(such as ac，bd)show that the difference was highly significant(P＜0.01).The same as in the following tables.

組別Group免疫時間(d)Immunization time(d) 0 10 20 30 40 50 60 70 EG－I 0 200 400a800a400c200c100c100 EG－II 0 200 400a800a1600a1600a800a400 EG－III 0 100 200b400b800b800b400b200 Control 0 0 0c0c0d0d0c0

由表1可以得出，EG－I、EG－II和EG－III在注射GnRH－A后10 d均出現(xiàn)GnRH抗體，對照組未檢測到GnRH抗體，實驗組始終高于對照組;在第10～30天時EG－I和EG－II組抗體效價相同，但顯著高于EG－III(P＜0.05)及對照組(P＜0.01);EG－I在第30天達(dá)到高峰，而EG－II和EG－III于40～50 d至峰值，然后抗體效價開始下降，但在實驗結(jié)束時(70 d) 3個實驗組仍高于對照組(P＜0.05);40～70 d時EG－II顯著高于EG－I和EG－III(P＜0.01)。表明兔體內(nèi)注射GnRH－A可以明顯提高GnRH抗體效價，加強注射效果更明顯，其持續(xù)時間為40 d左右。

2.3 血清LH濃度測定值見圖1。

圖1 兔血清LH濃度的變化Fig.1 Changes of serum luteinizing hormone concentration in the female rabbits

由圖1得出，EG－I的LH除注射后10 d略升高外，始終保持穩(wěn)定，這與對照組基本相同;EG－II和EG－III的LH均在注射后40 d至峰值(P＜0.05)，此后降低。30～50 d時EG－II明顯高于EG－I和EG－III及對照組，也高于注射前水平。證明加強注射GnRH－A可以增強LH的合成與分泌，而且與注射的劑量相關(guān)。

2.4 血清FSH濃度的測定值見表2。

從表2得出，EG－II和EG－III的FSH濃度在注射后30 d開始升高，至40 d達(dá)到峰值，EG－II明顯高于EG－I和對照組(P＜0.01)及EG－III(P＜0.05)，EG－III也高于EG－I和對照組(P＜0.05);整個實驗期間EG－I和對照組差異無顯著性。表明加強注射GnRH－A可以增強FSH的合成與分泌，而且注射劑量大作用更明顯。

3 討論

GnRH由丘腦下部合成，并以脈沖方式分泌進入垂體門脈系統(tǒng)，到達(dá)垂體前葉發(fā)揮誘導(dǎo)促性腺激素釋放的作用，調(diào)節(jié)垂體LH/FSH的合成與釋放［8，9］。GnRH與具有免疫原性的大分子蛋白載體偶聯(lián)后免疫動物，可誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗GnRH的抗體。Adams等［10］用鑰孔威血藍(lán)蛋白(keyhole limper hemocyain，KLH)與GnRH偶聯(lián)對小公牛進行免疫，20周后抗體效價達(dá)到最高值，Esbenshade等［11］用GnRH免疫母豬，也發(fā)現(xiàn)抗體效價在第15周達(dá)到最高。本實驗表明GnRH－A注射兔后10d實驗組血清中均可檢測到GnRH抗體，GnRH抗體在30 d左右達(dá)到高峰，其中EG－I、EG－II和EG－III的GnRH效價分別為為1∶800、1∶800和1∶400，EG－II (100 μg/m L加強組)在50 d時仍高達(dá)1∶1600，說明GnRH抗體效價有一定的持續(xù)時間，且與注射劑量密切相關(guān)，這與Bambino的結(jié)論相吻合。因此，為了更好的維持抗體高水平，加強免疫是必要。

表2 母兔血清FSH測定值(±s，m IU/m L)Tab.2 The concentration of serum follicle－stimulating hormone in the female rabbits(Unit:m IU/mL)

表2 母兔血清FSH測定值(±s，m IU/m L)Tab.2 The concentration of serum follicle－stimulating hormone in the female rabbits(Unit:m IU/mL)

組別Group免疫時間(d)Immunization time(d) 0 10 20 30 40 50 60 70 EG－I 1.361±0.078 1.425±0.123 1.427±0.202 1.350±0.213a1.338±0.097a1.359±0.186a1.369±0.193 1.362±0.207 EG－II 1.326±0.082 1.421±0.202 1.435±0.289 1.510±0.388b1.710±0.308c1.482±0.209b1.474±0.183 1.454±0.215 EG－III 1.419±0.127 1.425±0.195 1.410±0.301 1.525±0.375b1.626±0.345b1.458±0.231b1.345±0.207 1.314±0.267 Control 1.374±0.205 1.388±0.096 1.386±0.221 1.352±0.264a1.362±0.224a1.350±0.256a1.407±0.242 1.384±0.179

GnRH抗體可特異地中和動物體內(nèi)的GnRH，從而影響到與GnRH有關(guān)的LH和FSH等激素的合成與分泌，使動物正常的生殖性能發(fā)生改變。GnRH不但可通過影響垂體LH和FSH的分泌，而且還直接作用于性腺，調(diào)節(jié)性腺功能。GnRH主要是降低性腺上的LH受體的數(shù)量而不改變受體的親和力。GnRH免疫由于引起垂體促性腺激素尤其是LH水平的下降，將導(dǎo)致性腺、性激素的變化，最終導(dǎo)致生育力的降低甚至喪失［12］。Esbenshade等［11］用GnRH免疫母豬后血清中LH濃度在12周降到不可測的水平，這些研究結(jié)果表明GnRH免疫動物后，對內(nèi)源性LH和FSH的合成與分泌有特異性抑制作用。Clarke等［13］用GnRH免疫公羊和母羊，經(jīng)檢測免疫動物外用血液中LH和FSH水平，與對照組相比明顯降低。然而，葉聯(lián)順［14］用尿促性腺激素(HMG)加HcG對6～12月齡的新西蘭母兔進行超排處理，測定超排前后不同時期血清FSH、LH和P (孕激素)的濃度，結(jié)果表明FSH和LH分別在超排后96 h和15 h達(dá)高峰水平，證明家兔超排后生殖內(nèi)分泌激素有顯著性變化。由此可見，排卵前后血清生殖激素的濃度是不相同的。本實驗證明給兔在第3周強化免疫后LH和FSH水平增加，表現(xiàn)為EG－II的LH在30～50 d明顯高于EG－I和EG－III及對照組，也高于注射前水平，而EG－I和對照組無顯著差異;FSH濃度的變化與LH基本相同，EG－II和EGIII的FSH濃度在注射后30 d開始升高，至40 d達(dá)到峰值，EG－II明顯高于EG－I和對照組及EG－III。這是否與本實驗中的兔有排卵以及注射GnRH－A的劑量或次數(shù)有關(guān)尚待深入探討。

另外，一些體外實驗證實，垂體細(xì)胞受GnRH刺激時，LH和FSH的最大分泌量和基礎(chǔ)分泌量不同，LH的比率比FSH高，因此LH分泌量的變化幅度比FSH的大，本實驗也基本證明了這一點［15］。

［1］Chabbert－Buffet N.GnRH antagonists［J］.Clin Obster Gynecol 2003，46(2):254－264.

［2］郭紅宇，高云荷.GnRH類似物的研究進展［J］.中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2005;21(11):6－12.

［3］Martemucci G.Effect of CnRH on Conception rate in repeatbreeder dairy cows.Anim Breed Abst.1984，(53):1－245.

［4］馬玉林.應(yīng)用LRH－A提高青海高原毛肉兼川半細(xì)毛羊受胎率的試驗［J］.青海畜牧獸醫(yī)雜志.1998，28(2):5－6.

［5］吳結(jié)革，茹達(dá).GnRH及其類似物在動物繁殖中的應(yīng)用［J］.南京農(nóng)專學(xué)報.2000，16(3):48－51.

［6］王君偉.獸醫(yī)生物制品的質(zhì)量檢驗，獸醫(yī)生物制品的質(zhì)量管理和控制［M］.中國農(nóng)業(yè)出版社.2002:181－186.

［7］魏鎖成，張劍.GnRH－A免疫去勢對兔血清睪酮和血液細(xì)胞的作用［J］.中國實驗動物學(xué)報.2009，17(1):45－49.

［8］趙興緒.獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)［M］.第3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社. 2002:66－90.

［9］魏鎖成.動物免疫去勢的基本原理及其應(yīng)用［J］.西北民族大學(xué)學(xué)報，2006，17(2):49－53.

［10］Adams TE，Adams BM.Feedlot performance of steers and bulls actively immunized against gonadotropin releasing hormone［J］.J Animal Sci，1992，70(6):1691－1698.

［11］Eshcnshade KL.Active immunization of gilts against gonadotropin－releasing hormone［J］.Biol Reprod.1985，(33): 569－577.

［12］楊仕群.GnRH免疫及其在畜牧業(yè)上的應(yīng)用［J］.四川畜牧獸醫(yī).2004，31(1):35－38.

［13］Clarke IJ，Brown BW，Tran VV，et al.Neonatal immunization against gonadotropin－releasing hormone(GnRH)results in diminished GnRH secretion in adulthood［J］.Endocrinology. 1998，139(4):2007－2014.

［14］葉聯(lián)順，呂靜，計垣，等.新西蘭大耳自兔超排前后生殖內(nèi)分泌激素變化的研究［J］.西南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2003，28(5):805－807.

［15］Bambino TH，Schreiber JR，Hsueh AJ.Gonadotropin－releasing hormone and its agonist inhibit testicular luteinizing hormone receptor and steroidogenesis in immature and adult hypophysectomized rats［J］.Endocrinology.1980，(107):908－914.

GnRH-A Imm unization and the Changes of Reproductive Horm one Concentration in Fem ale Rabbits

WEI Suo－cheng1，2，GONG Zhuan－di3，WEI M in2，ZHAO Xing－xu1
(1.Gansu Agriculture University，Lanzhou 730070;2.Life Science and Engineering College; 3.Medical College，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030，China)

ObjectiveThe objective of this study was to investigate the efficacy and mechanisms of reproductive function immunological regulation by injecting gonadotropin releasing hormone analogue(GnRH－A)in animals.M ethods

24 female rabbits were divided random ly into four groups，namely experimental group 1(EG－I)，experimental group 2 (EG－II)，experimental group 3(EG－III)and control group(CG).The experimental groups were injected with GnRH－A antigen 1.0 m L at different doses(100 μg/m L，100 μg/m L and 50 μg/m L)，respectively，and the rabbits of EG－II and EG－III groups were re－injected at the original doses at the third week.Serum GnRH antibody titer，follicle－stimulating hormone(FSH)and luteinizing hormone(LH)concentrations were determined by ELISA.ResultsSerum GnRH antibody titers were detected in three experimental groups after 10 d of injecting GnRH－A，but not in the control group.The antibody titers of EG－I，EG－Ⅱand EG－Ⅲreached a peak level on d30 and d40～d50，respectively.The antibody titers of EG－II were higher than that of EG－I and EG－III(P＜0.01)during the period from 40 days to 70 days.LH concentration of EG－II exceeded other groups at 30 d－50 d.FSH concentrations of EG－II and EG－III reached the peak on 40 d，EG－II FSH was higher than other groups(P＜0.05).There was no significant difference between EG－Iand CG.ConlusionInjecting GnRH－A to rabbits may apparently improve GnRH antibody titer，enhance LH and FSH synthesis and secretion. Strengthening injection is more effective，lasting for about 40 days，and is related with the injecting dosage.

Gonadotropin;Releasing hormone analogues－A(GnRH－A);Luteinizing hormone;Folliclestimulating hormone;Female rabbit

S852.2

A

1005－4847(2010)03－0247－04

2009－09－27

國家民委2007年度重點資助項目(編號:MW 2007－ZD－027)。

魏鎖成(1962－)，男，教授，研究方向:動物醫(yī)學(xué)和動物生殖生物技術(shù)。E－mail:weisc668@163.com

趙興緒E－mail:zhaoxx@gsau.edu.cn