劉建，范慧敏，汪進(jìn)益，張治國，曹浩，蘭琴，史乾，唐光亮，劉中民

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心胸外科，上海 200120)

研究報告

小鼠心梗模型的建立與無創(chuàng)評價

劉建，范慧敏，汪進(jìn)益，張治國，曹浩，蘭琴，史乾，唐光亮，劉中民

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心胸外科，上海 200120)

目的建立小鼠的心肌梗死模型，提高動物存活率，并使用心臟超聲進(jìn)行無創(chuàng)心功能評價。方法昆明雄性小鼠20只，氣管插管后由左側(cè)第4肋間進(jìn)胸，結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立小鼠心肌梗死模型，在模型建立的前1 d和術(shù)后1 d、1周分別使用心臟超聲檢測左室收縮末直徑、舒張末直徑、縮短分?jǐn)?shù)和射血分?jǐn)?shù)，并于術(shù)后第8天進(jìn)行病理檢查。結(jié)果小鼠心肌梗死模型建立過程中早期死亡率10%(2/20)，術(shù)后1周內(nèi)死亡率15%(3/ 20)，經(jīng)過超聲評價，造模成功率為75%(15/20)。小鼠心功能明顯下降，射血分?jǐn)?shù)由手術(shù)前的(92.1±3.45)%下降到術(shù)后1周的(49.8±14.20)%，縮短分?jǐn)?shù)由手術(shù)前的(61.4±2.85)%下降到(26.1±9.01)%;心室明顯擴(kuò)大，左室收縮末直徑由(13.9±1.98)μm擴(kuò)大到(36.5±7.37)μm，舒張末直徑由(35.9±3.12)μm擴(kuò)大到(48.9± 6.05)μm。病理學(xué)檢查見明顯瘢痕形成。結(jié)論通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法建立了小鼠心肌梗死模型并可以使用超聲心動圖評價這一模型。

小鼠;模型，動物;心肌梗死;超聲心動圖

急性心肌梗死是當(dāng)代社會的多發(fā)病常見病，人們通過制作動物模型，為研究人心肌梗死的發(fā)病機(jī)制以及開展新療法提供基礎(chǔ)。以往傾向使用犬、豬、家兔等大中型動物來制備模型，但這一類動物價格比較貴，實驗成本高。隨著轉(zhuǎn)基因動物研究的進(jìn)展，越來越多的研究傾向于選擇基因敲除小鼠作為動物模型［1］。冠狀動脈結(jié)扎法是較為確切的一種制作小動物心肌梗死模型的方法［2］。但目前國內(nèi)對于小鼠的心肌梗死模型的建立研究較少，缺乏一種比較簡便的模型制作方法以及無創(chuàng)的術(shù)后評價手段，本文對此進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:昆明雄性小鼠20只，體質(zhì)量(25±5)g，來源于中科院上海實驗動物中心【SCXK(滬)2002—0010】。無菌手術(shù)在上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科學(xué)部屏障動物實驗設(shè)施進(jìn)行【SYXK(滬)2004－0005】，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑與儀器:鹽酸氯胺酮注射液(上海中西藥業(yè)股份有限公司)，利多卡因注射液(上海禾豐有限公司)，硫酸阿托品注射液(上海禾豐有限公司)，40%分析純甲醛(上海虹光化工廠)，甲苯噻嗪(Sigma公司)。高分辨率小動物超聲系統(tǒng)(VisualSonics?Vevo770?)，倒置顯微鏡(Nikon公司)，江灣I型小動物呼吸機(jī)(上海第二軍醫(yī)大學(xué)生理學(xué)研究所)，MPA生物信號采集分析系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)，顯微外科手術(shù)器械(蘇州醫(yī)療器械廠)。

1.2 方法

1.2.1 麻醉與術(shù)前準(zhǔn)備:將100 mg氯胺酮與10 mg甲苯噻嗪混合于生理鹽水中，配制成10 m L的麻醉合劑。根據(jù)小鼠體重，每10 g給予0.1 mL上述合劑。小鼠肌肉松弛充分后取仰臥位將頭部和四肢固定于手術(shù)臺上，將三根電極分別固定于兩上肢與右下肢，連接到MPA系統(tǒng)上，連續(xù)描記標(biāo)準(zhǔn)的II導(dǎo)聯(lián)心電圖。皮下注射少量阿托品減少氣管分泌物，對頸正中和左前胸進(jìn)行常規(guī)備皮消毒，在氣管喉結(jié)下方橫行切開，分離顯露氣管，在第3、4軟骨環(huán)間做氣管切開，使用22號套管穿刺針鞘進(jìn)行氣管插管并連接呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸參數(shù)為(吸呼比1∶1.5，呼吸頻率100次/分，潮氣量為0.4～0.6 m L)。

1.2.2 手術(shù)方法:小鼠改右側(cè)臥位，在距胸骨左緣0.3 cm處沿4、5肋間做橫行切口進(jìn)胸，暴露心臟，為保護(hù)小鼠膈神經(jīng)，不游離過多心包，僅在肺動脈主干與左心耳交界下方切開少許心包，以左心耳下緣為標(biāo)志，平左心耳前下角以8－0 proline絲線向右縫針，進(jìn)針深度1 mm左右，寬度1～1.5 mm，緩慢結(jié)扎以免撕裂心肌(結(jié)扎前皮下注射少量利多卡因)。結(jié)扎后觀察心室前壁變化，一般1 min左右左室前壁局部出現(xiàn)蒼白，部分小鼠出現(xiàn)短暫室性心律失常，給予利多卡因局部噴灑。動態(tài)觀察II導(dǎo)聯(lián)心電圖波形變化與病理性Q波出現(xiàn)與否。結(jié)扎滿意后使用3－0線逐層關(guān)閉胸腔。斷開呼吸機(jī)，胸外按壓數(shù)下幫助小鼠恢復(fù)自主呼吸后拔除氣管插管，簡單清理呼吸道，用氣管周圍肌肉閉合氣管，3－0線縫合皮膚。術(shù)后將小鼠放置于溫毯上過夜。

1.2.3 心臟超聲評價:術(shù)前1 d與術(shù)后1 d、1周將小鼠以1%異氟烷吸入麻醉后仰臥位固定，取胸骨旁短軸觀切面，M型超聲模式下記錄左室收縮末直徑(end systolic dimension，ESD)，舒張末直徑(end dilation dimension，EDD)，以及反映心室收縮功能的射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)，縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening，F(xiàn)S)。

1.2.4 病理學(xué)觀察:術(shù)后1周檢測完心功能后處死所有小鼠(同時使用未手術(shù)的小鼠作為對照)，留取心臟標(biāo)本，從心臟中部垂直與心臟長軸橫切左心室石蠟包埋，自心底向心尖部每隔1 μm切片，HE染色觀察。

2 結(jié)果

2.1 小鼠術(shù)后存活情況

小鼠冠狀動脈結(jié)扎術(shù)中早期死亡率為10%(2/ 20)，其中1只由于結(jié)扎位置偏高，引起室顫不能轉(zhuǎn)復(fù)心律而死亡，另1只由于進(jìn)針過深穿破心臟引起失血性休克而死亡。術(shù)后1周內(nèi)又陸續(xù)有3只死亡，其中2只尸檢發(fā)現(xiàn)胸腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)血凝塊，進(jìn)一步對心臟進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)左室前壁近心尖肌肉壞死處有明顯破口，另外1只死于肺部感染，但解剖心臟也有明顯瘢痕區(qū)形成。術(shù)后最后存活小鼠15只，存活率75%。

2.2 無創(chuàng)心功能檢測

術(shù)后1周存活的小鼠與術(shù)前1 d相比心功能有顯著下降，表現(xiàn)在左心室前壁變薄，心室射血分?jǐn)?shù)與縮短分?jǐn)?shù)下降，心室腔擴(kuò)大(P＜0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義);而術(shù)后1 d與術(shù)前并無明顯差異(P＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義)(表1)。

2.3 心肌組織病理形態(tài)學(xué)

常規(guī)HE染色后，與正常小鼠心肌組織比(圖1A)，術(shù)后1周小鼠心肌組織在顯微鏡下(圖1B)可見其呈區(qū)域性變性壞死，病變區(qū)肌纖維排列紊亂，肌絲斷裂溶解，細(xì)胞核固縮碎裂，間質(zhì)充血水腫明顯，有炎癥細(xì)胞浸潤，存活的心肌細(xì)胞呈島樣分布，周圍纖維肉芽組織增生，壞死心肌為纖維組織取代。圖1見彩插3。

表1 小鼠手術(shù)前后心功能與心室腔大小變化(n=15，±s)Tab.1 Changes of heart volume and function in the mice (n=15，±s)

表1 小鼠手術(shù)前后心功能與心室腔大小變化(n=15，±s)Tab.1 Changes of heart volume and function in the mice (n=15，±s)

測量時間Measurement of time術(shù)前1 d One day before operation術(shù)后1 d One day after operation術(shù)后1周One week after operation射血分?jǐn)?shù)(%)EF 92.1±3.45 90.4±5.62 49.8±14.20縮短分?jǐn)?shù)(%)FS 61.4±2.85 58.4±4.33 26.1±9.01左室舒張末直徑EDD(μm)35.9±3.12 40.5±5.22 48.9±6.05左室收縮末直徑ESD(μm)13.9±1.98 14.4±4.25 36.5±7.37

3 討論

由于小鼠易于飼養(yǎng)，繁殖力強(qiáng)，周期短，因而幾乎所有的轉(zhuǎn)基因動物都采用小鼠作為動物源［3］。許多心血管病研究方面的新進(jìn)展都是最先利用小鼠作為動物模型。但是小鼠制作心梗模型仍然具有一定的難度，與大鼠及其他大中型動物相比，小鼠生命力更弱，手術(shù)耐受差，術(shù)后評估效果更難［4］。因此，我們在大鼠成功制作模型并評價的基礎(chǔ)上［5］，對小鼠心梗模型的制作方法進(jìn)行了研究。

常規(guī)的心梗模型制作方法有冠脈結(jié)扎法、左室電灼法、液氮冷凍法和藥物法等。其中冠脈結(jié)扎法是通過閉塞冠狀動脈引起心肌缺血梗死，進(jìn)而心功能下降，比較符合臨床心肌梗死發(fā)病的實際生理特征，能比較好的適應(yīng)臨床上對心肌梗死病理過程的研究需要，而且該方法效果比較成熟，故本實驗采用這一方法。

成功的麻醉與良好的人工呼吸是制作心梗模型的前提。本實驗采用自己配制的氯胺酮與甲苯噻嗪的麻醉合劑，麻醉起效快，大約腹腔注射后5 min可以取得比較好的麻醉與肌松效果;一般可以穩(wěn)定維持一個小時左右，足夠滿足手術(shù)需要，即使出現(xiàn)個別小鼠出現(xiàn)麻藥耐受，追加首劑1/3也基本不會引起麻醉意外［6］;小鼠術(shù)后蘇醒很快，有助小鼠恢復(fù);此外，甲苯噻嗪有一定的鎮(zhèn)靜作用，使用后小鼠心率有所減慢，在一定程度上降低了手術(shù)時結(jié)扎的難度。本實驗經(jīng)頸部行氣管切開并經(jīng)該切口連接呼吸機(jī)，以往有文獻(xiàn)報道使用經(jīng)口氣管插管的方法可以減少出血等手術(shù)并發(fā)癥，但本實驗中發(fā)現(xiàn)小鼠頸部血管分布較少且清晰，頸部解剖結(jié)構(gòu)簡單，層次清楚，氣管切開基本不引起出血，切開后插管效果明確，不會出現(xiàn)經(jīng)口插管出現(xiàn)的誤入食道的現(xiàn)象;實驗中如出現(xiàn)氣管分泌物堵塞引起呼吸不暢的現(xiàn)象，可以立刻將套管針鞘取出進(jìn)行清理，復(fù)插方便;氣管切開穿刺針不經(jīng)過喉，不會引起術(shù)后喉頭水腫進(jìn)而窒息的情況;手術(shù)中要注意減少氣道分泌物，本實驗中通過插管前皮下注射少量阿托品來預(yù)防［7］。本實驗中采用暖光源，對小鼠的麻醉中保溫也起到了一定效果，經(jīng)過初期探索后，在實驗中小鼠并未出現(xiàn)因麻醉與人工呼吸死亡的現(xiàn)象。

成功結(jié)扎冠脈是模型制作的關(guān)鍵所在。首先是結(jié)扎位置，精確操作，并力爭在同一高度結(jié)扎是獲得比較均一的模型的關(guān)鍵;第二是進(jìn)針深度的控制，因為小鼠心室壁較薄，穿刺過深直接導(dǎo)致心臟破裂出血，一般控制在0.5～1 mm;另外結(jié)扎動作要熟練迅速，力爭一次成功，時間拖得過長或者重復(fù)結(jié)扎會增加發(fā)生室性心率的幾率。開胸后左肺與膈葉的保護(hù)也非常重要，肺損傷是小鼠術(shù)中與術(shù)后早期死亡的一個重要原因，開胸后適當(dāng)減小潮氣量與肺膨脹，需要牽拉與推開肺組織時要使用鹽水紗布或者棉花作為襯墊，千萬不要使用銳利器械直接牽拉肺組織。

小動物的常規(guī)心功能檢查手段有導(dǎo)管心腔內(nèi)壓力測量、朗根道夫灌注法等［8］，但均為有創(chuàng)，后者更是要處死動物，將心臟離體操作，操作復(fù)雜費時，且不能連續(xù)動態(tài)觀察小鼠的心功能。本實驗中我們采用心超無創(chuàng)的方法，連續(xù)動態(tài)觀察小鼠手術(shù)前后的心功能，不失為一種較好的小鼠心梗模型評價方法［9］。

(本文圖1見彩插3。)

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Estab lishm ent and Non-Invasive Assessm ent of a M ouse M odel of M yocardial In farction

LIU Jian，F(xiàn)AN Hui－min，WANG Jin－yi，ZHANG Zhi－guo，CAO Hao，LAN Qin，SHI Qian，TANG Guang－liang，LIU Zhong－min
(Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery of East Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200120，China)

Objective To establish a standardized mouse myocardial infarction model with a high survival rate，and non－invasively evaluate its cardiac function by echocardiography.M ethods A total of 20 Kunming male mice were enrolled into this study.The left anterior descending coronary artery was ligated through the left fourth intercostal space after intubation.The echocardiographic assessment of myocardial infarction and heart function was performed 1 day preoperatively，1 day and 1 week postoperatively.Pathological examination was performed 8 days postoperatively.The ejection fraction(EF)，shortening fraction (FS)，end systolic dimension(ESD)，and end diastolic dimension(EDD)were recorded and analyzed.Results The acute and one－week mortality rates were 10%(2/20)and 15%(3/20)，respectively.The echocardiography showed that the success rate of establishment of the infarction model was 75%(15/20).The heart function of the mice was markedly impaired.The EF and FS were significantly decreased from(92.1±3.45)%and(61.4±2.85)%to(49.8±14.20)%and(26.1±9.01)%(P＜0.001)，while EED and ESD were increased significantly［(35.9±3.12)μm and(13.9±1.98)μm vs.(48.9±6.05)μm and(36.5±7.37)μm，P＜0.001，respectively］.Pathological examination confirmed scar formation.Conlusions A mouse model of myocardial infarction has been successfully established by surgical ligation of the left anterior descending coronary artery and the heart functions can be evaluated by echocardiography.

M ice;Animal model;Myocardial infarction;Echocardiography

R654.1

A

1005－4847(2010)03－0196－03

2009－10－23

國家自然科學(xué)基金項目(30471719);上海市科委重點項目(064119504)。

劉建(1984－)，男，碩士，研究方向:頑固性心衰的外科治療及移植免疫。Email:4871174@qq.com

劉中民。Email:zhongmin－liu@sina.com