王波，程萱，劉慶軍，魏旭冉，尹玉靜，高旭，楊曉，周虹

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所，北京 100850;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071; 3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生化教研室，哈爾濱 150081)

研究報告

血紅素加氧酶－1顯性負(fù)性突變體轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立與鑒定

王波1，程萱2，劉慶軍1，魏旭冉1，尹玉靜1，高旭3，楊曉2，周虹1

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所，北京 100850;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071; 3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生化教研室，哈爾濱 150081)

目的建立血紅素加氧酶－1(heme oxygenase－1，HO－1)顯性負(fù)性突變體G143H轉(zhuǎn)基因小鼠模型。方法通過SalI/DraI酶切pCAGGHO－1G143H轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，純化回收HO－1G143H表達(dá)盒片段;通過顯微注射把表達(dá)目的基因的DNA片段導(dǎo)入FVB小鼠受精卵原核，并移植給同期發(fā)情的假孕受體母鼠，獲得子代小鼠;用PCR對子代鼠尾DNA進(jìn)行鑒定，并用Southern blot對結(jié)果做進(jìn)一步驗(yàn)證;通過RT－PCR、免疫組化和Western blot方法檢測HO－1基因的表達(dá)。結(jié)果表達(dá)盒回收片段正確;假孕鼠出生的17只子代小鼠共有3只陽性，均為雄性;RTPCR、免疫組化和Western blot結(jié)果表明，陽性小鼠體內(nèi)的HO－1 mRNA與蛋白表達(dá)水平增高。結(jié)論成功建立HO－1顯性負(fù)性突變體G143H表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，該模型為研究HO－1在體內(nèi)的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

HO－1;顯微注射法;轉(zhuǎn)基因小鼠

血紅素加氧酶－I(heme oxygenase－1，HO－1)是降解血紅素為膽綠素、CO和Fe2+的限速酶。它也是一種應(yīng)激蛋白，具有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡、下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子表達(dá)，減少血管損傷，增加移植器官的血流灌注等作用［1］。對HO－1基因缺失小鼠和一例患者的研究表明，HO－1在機(jī)體中起著非常重要的作用。HO－1缺失(缺失外顯子3和4以及外顯子5的一部分)的成年小鼠表現(xiàn)出異常貧血，鐵離子在血清中的含量降低，并且沉積于肝臟和腎臟，最終造成生物大分子的氧化損傷、組織損害和慢性炎癥。世界上唯一一例HO－1表達(dá)缺失的病例［2］，其母系HO－1等位基因第2外顯子完全缺失和其父系HO－1等位基因第3外顯子兩個核苷酸缺失。這一患者表現(xiàn)生長遲緩，持續(xù)的溶血性貧血、嚴(yán)重的持續(xù)性內(nèi)皮細(xì)胞損傷、鐵沉積、對氧化應(yīng)激損傷極度敏感。由此可見HO－1外顯子2－5對維持HO－1的正常功能都是必需的。

當(dāng)前，在動物水平開展的HO－1與疾病的相關(guān)性研究，主要是通過HO－1的誘導(dǎo)劑或抑制劑來改變機(jī)體的HO－1水平的方式來進(jìn)行的。但是這些試劑的作用機(jī)制復(fù)雜、缺乏特異性，故不利于問題的闡明。HO－1作為一種保護(hù)作用的酶，其作用就是將其有毒底物分解成有活性的產(chǎn)物，但是我們不清楚HO－1對機(jī)體的保護(hù)作用是通過HO－1對其底物的清除作用引起的，還是由其產(chǎn)生的活性產(chǎn)物的作用來發(fā)揮的。我們擬通過建立一種既能去除HO－1底物又能使HO－1產(chǎn)物降低的動物模型來研究HO－1在機(jī)體中的作用機(jī)理。HO－1的顯性負(fù)性突變體，即第143位甘氨酸(G)突變?yōu)榻M氨酸(H)(HO－1G143H)，可以產(chǎn)生一種只具有結(jié)合底物活性，但失去了催化分解活性［3］的HO－1。這種HO－1突變體在體內(nèi)將會通過與體內(nèi)HO－1競爭性結(jié)合底物，去除HO－1的有毒底物，同時由于HO－1的底物的相對量減少而使其產(chǎn)物生成減少。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pCAGG－HO－1G143H質(zhì)粒(本室保存)，大腸桿菌E.coil DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶SalⅠ、DraⅠ均為TaKaRa公司產(chǎn)品。兔抗HO－1一抗為本室制備。羅丹明標(biāo)記山羊抗兔二抗(中杉公司)。FVB鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供［SCXK(軍)2007－004］。

1.2 HO-1G 143H基因構(gòu)件制備

將質(zhì)粒pCAGGHO－1G143H用SalⅠ和DraⅠ酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。用QIA quick gel extraction kit純化回收目的片段(3177 bp)。純化后DNA溶于Microinjection buffer(pH 7.4)中，注射濃度為3 ng/μL。

1.3 顯微注射及F0代鼠的產(chǎn)生

將純化后的HO－1G143H片段通過顯微注射法注入FVB小鼠受精卵原核中，將注射后狀態(tài)良好的受精卵移植到FVB假孕母鼠的輸卵管內(nèi)，待F0代鼠產(chǎn)生。所有實(shí)驗(yàn)用小鼠均在SPF動物房中飼養(yǎng)和繁殖，溫度控制在22℃。

1.4 轉(zhuǎn)基因鼠的PCR檢測

剪取出生后15 d的鼠尾0.5～1 cm，用酚、氯仿提取DNA方法提取鼠尾DNA。引物序列為:F:5′－ggagcgtccacagcccgaca－3′，R:5′－tgagagtgaggacccactgg aggag－3′，擴(kuò)增片段長815 bp，PCR反應(yīng)條件為: 95℃5 min;94℃20 s→60℃10 s→72℃20 s，30循環(huán);72℃延伸10 m in。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 轉(zhuǎn)基因小鼠Southern b lot檢測

PCR檢測陽性轉(zhuǎn)基因小鼠子代及陰性對照鼠基因組DNA(約20 μg)，用HindⅢ過夜酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠處理后采用毛吸印跡法使DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用紫外交聯(lián)的方法使DNA固定于膜上。用NcoⅠ和SpeⅠ酶切注射片段，回收純化作為探針，32P標(biāo)記后，進(jìn)行雜交，洗膜，放射自顯影。

1.6 轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織RT-PCR檢測

選取轉(zhuǎn)基因子代小鼠的肝組織，使用Trizol試劑提取其組織總RNA。采用Promega RT－PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA及PCR擴(kuò)增進(jìn)行RNA水平表達(dá)的分析。HO－1基因PCR條件同上。以小鼠βactin基因設(shè)為內(nèi)對照，β－actin F:5′－aggagatc acagccctagca－3′，R:5′－tgaggctagcatgaggtgtg－3′。小鼠β－actin PCR擴(kuò)增條件為:95℃，5min;94℃，20 s→60℃，10 s→72℃，20 s，25個循環(huán);72℃，10 m in。瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

1.7 免疫組化法檢測HO-1基因的表達(dá)

取轉(zhuǎn)基因陽性F1代鼠和FVB野生小鼠的脾組織進(jìn)行冰凍切片，－20℃凍存。使用免疫組化SP試劑盒(中杉公司)進(jìn)行基因表達(dá)檢測。加入兔抗HO－1一抗4℃過夜，二抗為羅丹明標(biāo)記山羊抗兔IgG，37℃30 min，熒光激發(fā)拍照。

1.8 轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織HO-1的W estern blot檢測

選取轉(zhuǎn)基因鼠肝組織，勻漿后進(jìn)行BCA蛋白定量，各取50 μg蛋白進(jìn)行SDS－PAGE，200 mA恒流電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入按1∶2000稀釋anti－mouse HO－1一抗，孵育過夜，PBST洗膜后加入1∶5000濃度稀釋的山羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，PBST洗膜后，化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，顯影、定影。

2 結(jié)果

2.1 F0代轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生

回收純化得到3177 bp的片段。將純化后的HO－1G143H片段通過顯微注射法注入FVB小鼠受精卵雄原核中，將注射后狀態(tài)良好的受精卵移植到假孕母鼠的輸卵管內(nèi)，待F0代鼠產(chǎn)生。所有實(shí)驗(yàn)用小鼠均在SPF動物房中飼養(yǎng)和繁殖。共移植注射胚胎64枚給2只移植鼠，得到17只F0代鼠，PCR鑒定3只雄性鼠為陽性，其中一只傳下F1代。

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠PCR檢測結(jié)果

鼠尾基因組DNA PCR檢測結(jié)果:鼠尾基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳陽性小鼠在815 bp處可見擴(kuò)增條帶。見圖1。圖上顯示，陽性動物條帶特異、清晰。

注:M.DL2000 marker;1.野生鼠;2.陽性鼠;3.陽性對照。圖1鼠尾DNA PCR檢測結(jié)果Note:M.DL2000 marker;1.Non－transgenic mice;2.Transgenic mice;3.Positive controlFig.1 Result of PCR products from tails of the transgenic mice

2.3 鼠尾基因組DNA Southern b lot檢測結(jié)果

陽性F1代Southern blot檢測陽性，可見特異3.1 kb整合條帶，正常小鼠基因組DNA未見特異條帶(圖2)。結(jié)果顯示出陽性動物與陰性對照動物之間明顯的差異。

2.4 鼠肝組織RT-PCR檢測結(jié)果

PCR結(jié)果顯示HO－1mRNA陽性轉(zhuǎn)基因小鼠中高表達(dá)(圖3)。野生鼠HO－1轉(zhuǎn)錄水平明顯低于陽性鼠。

2.5 鼠脾免疫組化檢測結(jié)果

與野生鼠相比，轉(zhuǎn)基因鼠在脾紅髓區(qū)HO－1表達(dá)增多(圖4，彩插3)。可見轉(zhuǎn)基因鼠不僅是HO－1表達(dá)數(shù)量的增多，還有表達(dá)位置的不同。

2.6 鼠肝組織W estern b lot檢測結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠肝勻漿中HO－1蛋白高表達(dá)(圖5)。

注:1.野生鼠;2.陽性鼠。圖2鼠尾DNA Southern blot檢測結(jié)果Note:1.Non－transgenic m ice;2.Transgenic miceFig.2 Result of Southern blot of the DNA from the tail of transgenic mice

注:1.野生鼠;2.陽性鼠。圖3 HO－1 RT－PCR檢測結(jié)果Note:1.Non－transgenic mice;2.Transgenic miceFig.3 Fig.3 Results of electrophoresis of RT－PCR products of the transgenic mice

注:1.野生鼠;2.陽性鼠。圖5 HO－1 Western blot檢測結(jié)果Note:1.Non－transgenic mice;2.Transgenic miceFig.5 Expression of HO－1 in the liver detected western blot

3 討論

HO－1是血紅素分解代謝的關(guān)鍵酶，它與很多疾病密切相關(guān)，如腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療［1］，老年性癡呆癥、帕金森病、多發(fā)性硬化等退行性和非退行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病［4－6］。而且，HO－1在抗缺血/再灌注損傷(ischemia－reperfusion injury，IRI)方面具有很好的功效［7，8］。由此來看，HO－1表達(dá)與疾病關(guān)系密切。但其作用機(jī)制有待深入研究。

HO－1的底物和產(chǎn)物都具有生物學(xué)活性，其底物血紅素在機(jī)體中是致超氧自由基的主要物質(zhì);其產(chǎn)物(膽綠素、CO和Fe2+)具有抗氧化、抗凋亡、抑制免疫反應(yīng)等保護(hù)作用。HO－1對機(jī)體行使保護(hù)作用，一方面是降解體內(nèi)致超氧自由基的血紅素，另一方面HO－1通過其產(chǎn)物發(fā)揮對機(jī)體的保護(hù)作用。HO－1顯性負(fù)性突變體HO－1G143H，一方面與血紅素結(jié)合，與HO－1一起行使去除有毒底物的保護(hù)作用;另一方面，與機(jī)體HO－1競爭結(jié)合底物，致與HO－1結(jié)合的底物量減少，從而使HO－1的產(chǎn)物量減少?；诖?，本研究利用此突變體HO－1G143H建立的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的HO－1量不降低，而產(chǎn)物降低，以此來研究HO－1對動物的影響。

我們用PCR法和Southern blot法對子代鼠尾DNA進(jìn)行鑒定，結(jié)果我們獲得了3只陽性轉(zhuǎn)目的基因小鼠。3只F0代陽性鼠均為雄性，推測HO－1G143H可能對小鼠的性別有影響。我們將繼續(xù)關(guān)注HO－1G143H小鼠的病理變化。我們應(yīng)用RTPCR和Western blot檢測小鼠的HO－1 mRNA和蛋白水平表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因動物在肝組織中轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)都升高，說明HO－1G143H開始表達(dá)，免疫組化檢測HO－1在脾中的表達(dá)，結(jié)果表明HO－1在脾紅髓與白髓區(qū)均高表達(dá)。結(jié)果表明，成功建立了HO－1G143H轉(zhuǎn)基因小鼠。此小鼠體內(nèi)的HO－1去除血紅素的功能不變，但HO－1活性產(chǎn)物量降低，將為HO－1的在機(jī)體的作用機(jī)制和功能及其相關(guān)疾病的作用機(jī)制研究提供一種較好的動物模型。

(本文圖4見彩插3。)

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Estab lishm ent of a Transgenic M ouse M odel of Hem e Oxygenase-1 Dom inant Negative M utation

WANG Bo1，CHENG Xuan2，LIU Qing－jun1，WEI Xu－ran1，YIN Yu－jing1，GAO Xu3，YANG Xiao2，ZHOU Hong1
(1.Institute of Transfusion Medicine，Academy of M ilitary Medical Sciences，Beijing 100850，China; 2.Institute of Bioengineering，Beijing 100071; 3.Department of Biochem istry and Molecular Biology，Harbin Medical University，Harbin 150086)

ObjectiveTo establish a HO－1 dominant negative mutant G143H transgenic mouse model.M ethods

The purified HO－1G143H fragment，digested from pCAGGHO－1G143H plasmid with Sal I and Dra I，was microinjected into FVB superovulated pronuclear zygotes.The injected zygotes were transplanted into the oviducts of pseudopregnant m ice.The genotype of transgenic mice was identified by PCR and Southern blot.The HO－1 expression in the tissues of the transgenic mice was detected by RT－PCR，immunohistochem istry and Western blot.ResultsThree positive transgenic male m ice were detected from 17 viable offsprings.RT－PCR，immunohistochemistry and Western blot results demonstrated that the levels of HO－1 mRNA and protein were increased in the positive mice.ConlusionA HO－1 dominant negative mutant HO－1G143H transgenic mouse model has been established successfully.The transgenic m ice may serve as a suitable model for the research of HO－1action mechanisms in vivo.

HO－1;M icroinjection;Transgenic mice

Q3

A

1005－4847(2010)03－0181－04

2010－02－24

國家973項(xiàng)目(2009CB521702)。

王波(1976－)，男，博士研究生，專業(yè)方向:生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

周虹(1966－)，女，研究員，專業(yè)方向:生物化學(xué)與分子生物學(xué)(電話:010－66931982，E－mail:zhouhtt@yahoo.com.cn)。