向志光，陳煒，全雄志，董偉，曹興水，高珊，張曉娟，張海濤，張連峰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

研究報(bào)告

一個(gè)靈長(zhǎng)類(lèi)種屬特異基因—XAGE-3轉(zhuǎn)基因

向志光，陳煒，全雄志，董偉，曹興水，高珊，張曉娟，張海濤，張連峰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的分析XAGE-3基因在靈長(zhǎng)類(lèi)和嚙齒類(lèi)動(dòng)物的基因組中的同源性，通過(guò)轉(zhuǎn)基因研究XAGE-3基因在小鼠中的功能及生物學(xué)意義。方法根據(jù)Homologene及Taxplot數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)Blast比對(duì)方法分析XAGE-3在兩類(lèi)動(dòng)物基因組中的同源性;從人胎盤(pán)組織克隆XAGE-3基因，轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)，顯微注射方法得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，基因組PCR鑒定基因型，反轉(zhuǎn)錄PCR分析基因的表達(dá);Brdu標(biāo)記3周齡動(dòng)物顯示睪丸內(nèi)細(xì)胞的增殖。結(jié)果XAGE-3在人、黑猩猩和獼猴中存在高度同源基因，而在小鼠和大鼠中無(wú)同源區(qū)域;在基因型鑒定陽(yáng)性的5個(gè)首建系中3個(gè)品系睪丸組織目的基因表達(dá)較高，在傳代的兩個(gè)品系中，在小腸，胸腺，睪丸等組織中目的基因均有表達(dá);睪丸組織Brdu標(biāo)記顯示XAGE-3轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有更多的發(fā)育晚期的精細(xì)胞被標(biāo)記。結(jié)論XAGE-3作為靈長(zhǎng)類(lèi)種屬特有基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中影響了精細(xì)胞發(fā)育。

XAGE-3;種屬特異基因;轉(zhuǎn)基因

生物物種的進(jìn)化本質(zhì)是遺傳物質(zhì)基因組的進(jìn)化，包括基因的融合、倒位、易位、基因的丟失、新基因的出現(xiàn)等。這些正是促使物種發(fā)生分化的基礎(chǔ)?；蚪M學(xué)研究使得我們可以在DNA序列水平比較人類(lèi)和其他生物的差異，從而找到生命進(jìn)化的內(nèi)因。小鼠作為成熟的模式生物是除人類(lèi)之外基因組研究較為清楚的生物。通過(guò)比較，我們發(fā)現(xiàn)小鼠和人類(lèi)都有自己相對(duì)獨(dú)立的一些基因，這些基因在另外的物種基因組中是找不到的。

我們根據(jù)Homologene數(shù)據(jù)庫(kù)［1］對(duì)于小鼠(Musmusculus)、人(Homo sapiens)、大鼠(Rattus norvegicus)、黑猩猩(Pan troglodytes)等的同源基因進(jìn)行了比較，找出一些差異基因，又對(duì)找出的差異基因用Blast程序針對(duì)其他基因組進(jìn)行了比對(duì)，還在蛋白水平檢索了Taxplot［2］數(shù)據(jù)庫(kù)，從而找到了人類(lèi)與小鼠存在差異的基因，這些基因存在一些共性，在基因的功能上更多的是和生殖、免疫、嗅覺(jué)等相關(guān)。

XAGE-3基因(X antigen family，member 3)就是通過(guò)上面的方法找到的一種靈長(zhǎng)類(lèi)種屬特異基因，該基因在人類(lèi)的近親黑猩猩和獼猴(Macaca mulatta)存在同源基因，而在小鼠和大鼠中不存在該基因的同源基因。根據(jù)EST數(shù)據(jù)庫(kù)，XAGE－3基因位于人類(lèi)的X染色體短臂11區(qū)21至22帶之間，它主要在人類(lèi)胎盤(pán)和早期胚胎組織中表達(dá)。由于存在著變位剪切，該基因有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本(NM_133179，NM_130776)，但是兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的蛋白編碼序列是相同的。因?yàn)楹蚗AGE1D基因(X antigen family，member 1D)位置靠近，被命名為XAGE-3，而實(shí)際上該基因在序列上和XAGE1D無(wú)相似性。為了研究該基因的可能功能，我們構(gòu)建了以CMV為啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因載體，通過(guò)顯微注射得到XAGE-3轉(zhuǎn)基因小鼠。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中使用的動(dòng)物為C57BL/6J小鼠購(gòu)自北京康藍(lán)生物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2005－0013】。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)(GC－08－2032)。

1.2 數(shù)據(jù)庫(kù)的使用

實(shí)驗(yàn)使用了NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Homologene，限定物種，采用邏輯減法，篩選靈長(zhǎng)類(lèi)種屬特異基因，即Homo sapiens-Mus musculus，同時(shí)參考兩個(gè)物種的近緣物種大鼠和黑猩猩的比較信息。也使用了關(guān)鍵詞“gene exclusive to homo sapiens”檢索Homologene數(shù)據(jù)庫(kù)。XAGE3即在這一策略下檢索出，又對(duì)小鼠基因組在DNA和蛋白水平進(jìn)行比對(duì)，參考TaxPlot數(shù)據(jù)庫(kù)，確定基因的種屬特異性。

1.3 基因的克隆

使用Trizol(Invitrogen)提取人胎盤(pán)組織總RNA，用Superscript III反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)以O(shè)ligodT合成cDNA第一鏈，以此為模板擴(kuò)增目的基因。上下游引物分別為5′－ttggtaccgcagctgtgtgaaatatg－ 3′;5′－gcgaattccttcatttaaacctgtgg－3′。經(jīng)94℃3 min預(yù)變性，后擴(kuò)增30循環(huán)，依次為變性94℃30 s，復(fù)性58℃30 s，延伸72℃1 m in。最后72℃延伸10 m in。

1.4 載體的構(gòu)建和顯微注射

擴(kuò)增的目的基因兩端帶有酶切位點(diǎn)Kpn I和EcoR I，插入真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，挑選克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，測(cè)序正確后擴(kuò)增質(zhì)粒。線(xiàn)性化質(zhì)粒，保留表達(dá)元件。用顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.5 鼠尾基因組的提取和基因型的鑒定

剪0.5 cm鼠尾加入500 μL裂解液(Tris－Cl，pH 8.0，EDTA 0.005 mol/L，SDS 0.1%，Protease K 20 μg/m L)，55℃搖動(dòng)過(guò)夜，加入300 μL飽和NaCl，顛倒混勻置冰上10 m in，10 000 g離心10 m in取上清600 μL，加等量異丙醇輕柔混勻，看到沉淀，離心，70%乙醇洗滌DNA沉淀，100 μL TE溶解DNA。取1 μg DNA進(jìn)行PCR鑒定。所用反應(yīng)條件與之前擴(kuò)增目的基因相同。

1.6 RT-PCR

Trizol提取組織RNA，RNA經(jīng)DNase I(RNase free，New England Biolab)消化處理，用相同條件行半定量PCR。用管家基因GAPDH為內(nèi)對(duì)照，引物為5′－tccaccaccctgttgctgta－3′;5′－accacagtccatgccatcac－3′。調(diào)整PCR循環(huán)數(shù)，GAPDH為20，XAGE－3的擴(kuò)增為28。

1.7 Brdu標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

使用Zymed公司Brdu標(biāo)記試劑和檢測(cè)試劑盒，按照試劑盒方法腹腔注射BrdU入3周齡雄性小鼠。XAGE－3轉(zhuǎn)基因組和對(duì)照組各3只。2 h后處死動(dòng)物取睪丸，中性甲醛固定72 h以上，石蠟包埋切片。按照試劑盒方法進(jìn)行BrdU抗體染色。

2 結(jié)果

2.1 XAGE-3基因是靈長(zhǎng)類(lèi)種屬特異基因

Taxp lot是基于不同物種蛋白序列的比對(duì)結(jié)果分析某一基因在不同物種同源性的一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)工具。圖1A(彩插1)為將人類(lèi)基因組(Homo sapiens，ID9606)同小鼠基因組(Mus musculus，ID10090)和大鼠基因組(Rattus norvegicus，ID10116)的比較圖。每一點(diǎn)代表某一基因的同源性，坐標(biāo)值為相似度。XAGE－3基因的位點(diǎn)為紅點(diǎn)所示，在圖1A位于0點(diǎn)附近(箭頭a所指處)，確定為人類(lèi)的XAGE－3基因在小鼠和大鼠的基因組中的同源性較低。圖1B(彩插1)為人類(lèi)基因組和近親黑猩猩基因組(Pantroglodytes，ID9598)獼猴基因組(Macaca mulatta，ID9544)比較，XAGE-3的相似度在500以上(箭頭b所指處)。這說(shuō)明XAGE-3基因在靈長(zhǎng)類(lèi)存在同源性基因，而在嚙齒類(lèi)中并不存在，和嚙齒類(lèi)相比是靈長(zhǎng)類(lèi)的特有基因。

為了確證XAGE-3基因的同源性，我們?cè)诤怂嵝蛄泻偷鞍仔蛄兴绞褂肗CBI中的程序Blastn和Blastp分別比對(duì)了小鼠的基因組，無(wú)同源信息。就目前的基因組學(xué)信息和比較方法，靈長(zhǎng)類(lèi)種屬特異基因XAGE-3在小鼠的基因組中無(wú)同源性序列。

2.2 目的基因的克隆和載體的構(gòu)建

我們從胎盤(pán)組織、正常人外周血、人腫瘤細(xì)胞系擴(kuò)增目的基因，只在正常胎盤(pán)組織中擴(kuò)出目的基因，這一點(diǎn)和EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息相吻合。擴(kuò)出的XAGE-3基因的開(kāi)放讀框通過(guò)Kpn I和EcoR I酶切位點(diǎn)連入真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)，經(jīng)Bgl II線(xiàn)性化后，顯微注射制備轉(zhuǎn)基因鼠。見(jiàn)圖2。

注:A.胎盤(pán)組織提取的總RNA;B.為擴(kuò)增的目的基因，左為目的條帶，大小為373 bp，左為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 (Takara);C.為酶切結(jié)果，箭頭d指向切出的載體，e箭頭指向插入片段。兩個(gè)分子量標(biāo)準(zhǔn)分別為DL15000和DL2000(Takara)圖2 XAGE-3分子克隆和載體構(gòu)建Note:A Shows the total RNA from placenta;B shows the amplified XAGE-3 at 373 bp，the marker is DL2000(Takara); C shows the identification of constructed vector，arrow d shows the linearized vector，arrow e shows the DNA inserted fragment，The markers are DL15000 and DL2000(Takara).Fig.2 Cloning of XAGE-3 and expression vector construction

2.3 動(dòng)物基因型的確定

XAGE-3轉(zhuǎn)基因鼠鼠尾DNA通過(guò)PCR基因型鑒定，共得到5個(gè)首建鼠，趾號(hào)1、13、16、25、34。確定為F0代。F0代動(dòng)物和野生型C57BL/6J雜交，得到F1代動(dòng)物，鼠尾DNA經(jīng)PCR鑒定，5個(gè)品系均有陽(yáng)性，陽(yáng)性比率約為50%，部分動(dòng)物傳代至F2，F(xiàn)3。見(jiàn)圖3。

注:N為野生動(dòng)物對(duì)照，P為陽(yáng)性對(duì)照。H2O作擴(kuò)增系統(tǒng)對(duì)照。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)為DL2000(Takara)圖3首建鼠基因型PCR鑒定Note:N is wild type control，P is positive control，H is water as system control.The marker is DL2000(Takara).Fig.3 PCR genotyping of the founder mice

2.4 基因表達(dá)的分析

取5個(gè)品系F1代1月齡雄性動(dòng)物睪丸組織行反轉(zhuǎn)錄PCR，圖4A中可以看出在13，16，34中目的基因有較高表達(dá)，選取13、16號(hào)動(dòng)物品系分析目的基因在其他組織中的表達(dá)(圖4B、C)，目的基因在所選組織均有表達(dá)，表達(dá)豐度在兩個(gè)品系不同組織間存在一些差異，但是在兩個(gè)品系中睪丸組織目的基因的高表達(dá)一致。見(jiàn)圖4。

注:A.不同首建鼠睪丸組織XAGE-3表達(dá)豐度的檢測(cè)，WT為野生小鼠睪丸組織樣品，選擇13和16號(hào)founder進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);B、C.13和16號(hào)品系XAGE-3基因不同組織表達(dá)的檢測(cè)。圖4 RT－PCR檢測(cè)XAGE-3表達(dá)Note:A shows XAGE-3 expression in the testis in different lines，WT is wild type mouse，line 13 and line 16 were chosen for subsequent analysis;B and C show the expression pattern in different tissues in line 13 and line 16.Fig.4 XAGE-3 expression detected by RT－PCR analysis

2.5 對(duì)精母細(xì)胞的影響

在對(duì)于3周齡雄性小鼠進(jìn)行Brdu標(biāo)記2 h后，我們對(duì)小鼠睪丸取材，剪開(kāi)包膜固定3 d以上，脫水石蠟包埋切片，切片脫水，用Brdu標(biāo)記試劑盒檢測(cè)被標(biāo)記細(xì)胞，在圖5(彩插1)中可以看出，XAGE－3轉(zhuǎn)基因動(dòng)物被標(biāo)記的細(xì)胞有較多的處于初級(jí)精母細(xì)胞階段(圖5B，箭頭所示)，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ談?dòng)物被標(biāo)記的細(xì)胞多為未發(fā)生減數(shù)分裂的精原細(xì)胞(圖5A，箭頭所示)。

3 討論

物種的進(jìn)化是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程。人類(lèi)和小鼠作為哺乳動(dòng)物他們有共同的祖先［3］。人類(lèi)屬于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，而小鼠屬于嚙齒類(lèi)，他們的生活環(huán)境不同，生活習(xí)性也存在差異。比如小鼠的繁殖方式為一胎多仔，由于生活環(huán)境較陰暗，他們進(jìn)化了高度發(fā)達(dá)的嗅覺(jué)系統(tǒng)。而在基因水平靈長(zhǎng)類(lèi)物種的嗅覺(jué)基因有更多的處于失活狀態(tài)［4］。人類(lèi)和小鼠的基因組測(cè)序完整程度較高，通過(guò)兩個(gè)物種的比較，人們發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)物種在免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、嗅覺(jué)等方面存在更多的物種特異基因［5］。這一情況在考慮到物種生活習(xí)性等方面的差異后就容易理解了。

我們利用了NCBI的同源基因數(shù)據(jù)庫(kù)Homologene對(duì)人類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi)物種特異基因篩查，該數(shù)據(jù)庫(kù)將不同物種的基因按照同源性進(jìn)行聚類(lèi)，雖然這種同源性包括某一基因在同一物種內(nèi)結(jié)構(gòu)相似的一些基因，也有物種之間的同源。將數(shù)據(jù)庫(kù)的信息按照物種(organism)先聚類(lèi)，這一物種所有通過(guò)聚類(lèi)分析的基因都在這一類(lèi)。通過(guò)邏輯減法，將不同的物種聚類(lèi)進(jìn)行比較，可以找到這樣的基因，它只屬于被減的物種，而在另一物種該聚類(lèi)基因不存在。關(guān)鍵詞的檢索也被使用。Gene exclusive to H.sapiens作為關(guān)鍵詞檢索數(shù)據(jù)庫(kù)也得到一些基因，這種檢索方法得到的信息不是非常嚴(yán)格，所有的方法得到的結(jié)果均需驗(yàn)證?；蚪M的比對(duì)(blast)是第一輪的驗(yàn)證。將被選基因和小鼠的基因組比對(duì)，我們研究的目的基因XAGE-3在小鼠基因組沒(méi)有同源區(qū)域(結(jié)果沒(méi)有顯示)，之后又在Taxplot平臺(tái)進(jìn)行分析，結(jié)果可以看出XAGE-3因在人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)近親物種同源參數(shù)大于500，而和嚙齒類(lèi)動(dòng)物大鼠、小鼠的同源參數(shù)接近于零。這一點(diǎn)可以說(shuō)明就目前的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行的生物信息學(xué)分析XAGE-3基因在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同源序列，而在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的3個(gè)物種該基因同源性較高。

XAGE-3因?qū)儆赬AGE基因家族，因?yàn)樽湓赬染色體上，在結(jié)構(gòu)上和GAGE基因簇相似，故而名為XAGE。XAGE基因家族的成員XAGE1b和小細(xì)胞肺癌的發(fā)生相關(guān)［6］，這一點(diǎn)和GAGE基因家族相似。但是XAGE-3和XAGE1b在結(jié)構(gòu)上并沒(méi)有太多共同點(diǎn)，只是因?yàn)樽湓谕蝗旧w區(qū)，這一區(qū)域的基因被命名為XAGE－1，2，3，5等。XAGE基因家族和MAGE基因家族相似，是作為腫瘤相關(guān)基因而被關(guān)注的。這類(lèi)基因主要表達(dá)于人類(lèi)腫瘤組織和一些胚胎期組織以及生殖相關(guān)組織。由于其表達(dá)譜的狀況，該基因也屬于CT(cancer－testis)antigens家族。而這些靈長(zhǎng)類(lèi)特異基因?qū)嶋H上正處在高度進(jìn)化的狀態(tài)［7］(cancer testis evolution)。在研究之初我們?cè)噲D從人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系中克隆該基因，在5種不同來(lái)源的人類(lèi)細(xì)胞系中并不能擴(kuò)出該基因(結(jié)果未展示)。而EST數(shù)據(jù)顯示該基因表達(dá)于人類(lèi)胎盤(pán)組織。隨后我們從志愿者的胎盤(pán)組織中擴(kuò)出該基因，證實(shí)該基因在生殖系統(tǒng)胎盤(pán)中的表達(dá)。了解這些基因的生物學(xué)意義有助于我們對(duì)物種進(jìn)化的理解。

我們制備的靈長(zhǎng)類(lèi)特異基因XAGE-3轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)現(xiàn)了該基因在小鼠特別是睪丸組織的高表達(dá)。分析睪丸組織細(xì)胞分裂增殖情況，結(jié)果表明小鼠表達(dá)XAGE-3后，在3周齡時(shí)轉(zhuǎn)基因小鼠有更多的細(xì)胞發(fā)育至初級(jí)精母細(xì)胞，而在非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的睪丸中更多的生精細(xì)胞處在精母細(xì)胞之前精原細(xì)胞或生殖干細(xì)胞的狀態(tài)。這說(shuō)明XAGE-3的表達(dá)加速了精子細(xì)胞的發(fā)生，但是這其中的機(jī)制目前我們了解甚少，對(duì)于該基因在生物體的真正意義我們尚需進(jìn)一步的研究。

(本文圖1、圖5見(jiàn)彩插1。)

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XAGE-3，A Primate Specific Gene Transgenic Research

XIANG Zhi－guang，CHEN Wei，QUAN Xiong－zhi，DONG Wei，CAO Xin－shui，GAO Shan，ZHANG Xiao－juan，ZHANG Hai－tao，Zhang Lian－feng
(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College，Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo assess the XAGE-3 homologous characteristics in primate and rodent species，and to analyze the XAGE-3 biological function in transgenic mice.M ethods Based on the databases Homologene and Taxplot，to compare the homologous characteristics in different genomes，to clone XAGE-3 gene from human placenta，to construct the eukaryotic expression vector pCDNA3.1(+)，to create transgenic mice by microinjection，to identify the genotyping and the expression of transformed gene by genomic PCR and reverse transcription PCR，and to check the proliferation of spermatocytes in transgenic m ice and control ones by BrdU labeling.ResultsThe XAGE-3 gene had homologs in Homo sapiens，Pan troglodytes and Macaca mulatta，not in Mus musculus and Rattus norvegicus.XAGE-3 gene expression was detected in the testis in 3 of 5 transgenic lines，and in 2 lines chosen for phenotype analysis.The expression was detected in the intestine，thymus and testis.More spermatocytes were labeled by BrdU in transgenic mice compared with that in the negative control.ConlusionPrimate species specific gene XAGE-3 may affect the proliferation of spermatacytes.

XAGE-3;Species specific gene;Transgenic mice

R－394.11

A

1005－4847(2010)02－0096－04

2009－12－17

衛(wèi)生部項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類(lèi)疾病動(dòng)物模型資源擴(kuò)展(200802036);十一五新藥專(zhuān)項(xiàng)支持(2009ZX09501－026)。

向志光(1980－)，男，博士研究生，研究方向:遺傳工程。E－mail:xiangzhg@yahoo.com

張連峰，Tel:87778442，E－mail:Zhanglf@cnilas.org