樊江波，暢洪昇，董世芬，閆興麗，王晶，洪纓

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102)

研究報告

慢性應激致腸易激綜合征大鼠模型的建立與評價

樊江波，暢洪昇，董世芬，閆興麗，王晶，洪纓

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102)

目的建立一種模擬腸易激綜合征臨床癥狀的動物模型，為相關(guān)藥物的研究提供實驗基礎(chǔ)。方法采用孤養(yǎng)附加慢性不可預見性刺激建立IBS模型，每只大鼠受到的刺激因子包括:24 h禁水、24 h禁食、晝夜顛倒、4℃冰水游泳15 min、45℃高溫5 min、鉗尾致痛1 min、束縛制動5～8 h、高速震蕩15 min等共8種，每種刺激因子出現(xiàn)5次，共40 d。用腹部回撤反射壓力閾值(AWR)和排便粒數(shù)檢測動物的內(nèi)臟感覺和胃腸運動功能變化;用敞箱行為評分和蔗糖水偏嗜度評價動物神經(jīng)精神活動變化。結(jié)果造模2～3周腹部回撤反射壓力閾值明顯降低，排便粒數(shù)明顯增加;造模3～4周模型組動物敞箱實驗行為評分和蔗糖水偏嗜度明顯降低。造模40 d時，上述變化趨勢仍存在。結(jié)論慢性應激加孤養(yǎng)可誘導動物胃腸運動亢進、內(nèi)臟感覺致敏和神經(jīng)精神活動的改變，模擬IBS患者的臨床特征，可作為一種有效的IBS動物模型，用于評價相關(guān)藥物。

腸易激綜合征;慢性應激;胃腸運動;內(nèi)臟感覺;神經(jīng)精神活動;大鼠

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種以腹痛或腹部不適癥狀為主，伴有大便性狀和排便習慣改變的功能性胃腸疾病，胃腸道運動異常和內(nèi)臟敏感性增高是其重要病理生理特征［1］。但由于該病缺乏特征性的生化和形態(tài)學鑒別標準，使得其病因、發(fā)病機制及相關(guān)藥物的研究受到一定限制。近年來發(fā)現(xiàn)，IBS患者存在著明顯的精神心理障礙，主要以抑郁、焦慮及軀體化表現(xiàn)為主，而且IBS患者的腹脹、腹痛、排便次數(shù)和性狀的改變等癥狀與精神情緒的變化密切相關(guān)。而抗抑郁藥物如氟西丁等可明顯改善IBS患者的消化道癥狀，顯示IBS是一種典型的身心疾?。?］。目前已經(jīng)明確，應激刺激可導致情緒及精神狀態(tài)的變化，是導致抑郁癥發(fā)生的重要原因之一，同時有研究表明，應激刺激可以改變結(jié)腸和小腸運動，并且可以增加內(nèi)臟感覺的敏感性，提示其在功能性胃腸疾病發(fā)病過程中同樣起重要的作用［3］。

本研究通過給予大鼠不可預見性的慢性應激刺激，觀察動物胃腸道功能的變化和神經(jīng)精神活動的變化，目的在于建立一種模擬臨床IBS患者癥狀的大鼠模型，為進一步研究IBS的發(fā)病機制和相關(guān)藥物提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物

SD大鼠，體質(zhì)量160～180 g，雄性。北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2002－0003】。動物于(20±2)℃，濕度60%～70%，12 h明暗的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)3 d后開始實驗。

1.2 主要儀器和試劑

Maclab/400生物信號記錄儀，澳大利亞;WZB－50微量注射泵，長沙健源醫(yī)療器械有限公司;熱烘箱，上海樹立儀表有限公司;振蕩器，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;橡膠氣囊(直徑1 cm，長度2 cm)，北京萍琴乳膠制品加工廠;大鼠透明有機玻璃固定盒(20 cm×6 cm×8 cm)為自制。乙醚:北京北化精細化學品有限責任公司提供，批號:060526。

1.3 方法

1.3.1 模型制備:動物隨機分為對照組與模型組。對照組大鼠每籠7～8只，常規(guī)飼養(yǎng)。模型組大鼠每籠單只孤養(yǎng)，并參照文獻［4］施加以慢性不可預見性的刺激。刺激因子包括:禁水、禁食、晝夜顛倒、冷刺激、熱刺激、致痛、制動、高速震蕩等8種。每只動物連續(xù)遭受上述刺激共40 d，每種刺激各出現(xiàn)5次，刺激因子種類在40 d內(nèi)隨機安排，每日一種，每種刺激不連續(xù)出現(xiàn)5次，使動物不能預料刺激的發(fā)生。對照組不予任何刺激。

應激操作方法:①禁水:24 h斷水。②禁食:24 h斷食。③晝夜顛倒:于早7時將動物放入暗室中，不開燈使動物處于黑暗狀態(tài);至晚7時將暗室照明燈打開，使動物處于光照狀態(tài)，至次日早7時取出。④冷刺激:將動物置于盛有4℃冰水的桶中(水深15 cm)，5 m in后取出。⑤熱刺激:將動物置于45℃的烘箱中5 m in。⑥致痛:將動物放入固定籠中，露出尾部，用止血鉗夾住距尾尖1 cm處(力度使動物發(fā)出哀叫聲即可)持續(xù)1 min。⑦制動:將動物置于固定籠中，使其四肢頭部不能隨意擺動。第一次制動束縛5 h，以后時間依次遞增1 h。⑧高速震蕩:將動物放入振蕩器中，高速水平震蕩(110次/分)15 min后取出。

1.3.2 腹部回撤反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)壓力閾值測定［5］:將橡膠氣囊與塑料導管(直徑2 mm)相連，并用0號手術(shù)線扎緊。如圖1(封二)所示，將導管、微量注射泵和壓力換能器分別與三通管相連接，使管路密閉不漏氣，用Maclab記錄壓力變化曲線。

進行測定前，大鼠禁食12 h，乙醚麻醉后，將氣囊由肛門插入約6 cm。固定導管與大鼠尾部，防止氣囊滑出。將大鼠置入透明有機玻璃固定盒中，待其蘇醒后適應30 min，用微量注射泵對氣囊恒速注氣加壓，速度為20 m L/m in。同時觀察大鼠行為，如圖2(封二)所示，當大鼠出現(xiàn)腹部肌肉收縮時，標記此時所示壓力為疼痛壓力閾值。持續(xù)加壓，當大鼠出現(xiàn)身體呈弓形，盆骨抬起時，標記其壓力為最大耐受壓力閾值。分別測定造模前后每只大鼠腹部回撤反射(AWR)壓力閾值。

1.3.3 排便測定:動物置于代謝籠中，測定各組大鼠2 h內(nèi)排便粒數(shù)。

1.3.4 敞箱實驗(open－field test):所用敞箱高40 cm，長寬均為80 cm，周壁為黑色，白色地面用黑線劃分為面積相等的25塊，敞箱中央上方1 m處懸掛1只100 W燈泡［5］。實驗在黑暗、安靜的房間中進行。將單只大鼠置于清潔敞箱中央，測定動物穿越地面方塊數(shù)作為水平運動得分，以站立次數(shù)為垂直運動得分。

1.3.5 糖水消耗實驗:首先對動物進行蔗糖水飲用訓練:在隔噪音、安靜的房間內(nèi)，每籠同時放置2個水瓶，第1個24 h，兩瓶均裝有1%蔗糖水。隨后的24 h，1個瓶裝有1%蔗糖水，1個瓶裝純凈水。隨后將動物禁食禁水，24 h后進行基礎(chǔ)糖水/純水消耗實驗:同時給予每只大鼠事先定量好的兩瓶水:1瓶1%蔗糖水，1瓶純水。4 h后，分別測定糖水和純水的消耗量，按下式計算動物的糖水偏嗜度，比較造模前后蔗糖水偏嗜度的變化［6］。

糖水偏嗜度=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 慢性應激刺激對大鼠AWR壓力閾值的影響

AWR壓力閾值反映內(nèi)臟感覺狀態(tài)。給予應激刺激前，模型組動物的AWR閾值，包括疼痛壓力閾值及最大耐受壓力閾值與正常對照組比較均無統(tǒng)計學差異。

給予應激刺激后，大鼠AWR閾值降低，表明動物的內(nèi)臟敏感性提高。其中在給予應激刺激后10 d及20 d時，模型組動物的疼痛壓力閾值和最大耐受壓力閾值降低，且與對照組相比具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。在應激30 d、40 d時，模型組動物疼痛壓力閾值及最大耐受壓力閾值仍然處于較低水平，但與對照組相比無差異。如表1、2所示。

表1 慢性應激對大鼠疼痛壓力閾值的影響(±s，n=15)Tab.1 Changes of pain pressure threshold in the rats induced by chronic stress

表1 慢性應激對大鼠疼痛壓力閾值的影響(±s，n=15)Tab.1 Changes of pain pressure threshold in the rats induced by chronic stress

注:與模型組比較，**P＜0.01，差異有顯著性。Note:**P＜0.01 highly significant difference;cs:chronic stress.

組別Group疼痛壓力閾值(mmHg)Pressure threshold of pain sensation造模前Pre－cs 10 d d10 post－cs 20 d d20 post－cs 32 d d32 post－cs 40 d d40 post－cs對照Control 31.64±9.03 35.58±11.86**34.4±8.95**41.23±12.15 40.61±9.12模型Model 31.27±7.11 24.59±3.97 24.63±3.72 36.15±10.49 32.87±9.47

表2 慢性應激對大鼠最大耐受壓力閾值的影響(±s，n=15)Tab.2 Changes of tolerant pressure in the rats induced by chronic stress

表2 慢性應激對大鼠最大耐受壓力閾值的影響(±s，n=15)Tab.2 Changes of tolerant pressure in the rats induced by chronic stress

注:與模型組比較，*P＜0.05差異有顯著性。Note:*P＜0.05 significant difference vs.model group;cs:chronic stress.

組別Group最大耐受壓力閾值(mmHg)Tolerant pressure造模前Pre－cs 10 d d10 post－cs 20 d d20 post－cs 32 d d32 post－cs 40 d d40 post－cs對照Control 49.01±12.44 49.11±12.73*49.64±10.74*58.95±13.85 57.04±9.05模型Model 49.05±8.65 39.4±8.24 40.03±6.12 53.08±11.14 51.85±11.68

2.2 慢性應激刺激對大鼠排便的影響

給予應激刺激后，模型組大鼠排便數(shù)量明顯增加，其中應激后7 d、15 d、24 d、29 d時，與對照組比較差異明顯(P＜0.05)。在應激40d時，模型組動物排便仍多于對照組，但統(tǒng)計學差異不明顯。如表3所示。

表3 慢性應激對大鼠排便的影響(±s，n=15) Tab.3 Effect of chronic stress on defecation of the rats

表3 慢性應激對大鼠排便的影響(±s，n=15) Tab.3 Effect of chronic stress on defecation of the rats

注:與模型組比較，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05，差異有顯著性。Note:***P＜0.001 very significant difference，**P＜0.01 highly significant difference，*P＜0.05 significant difference vs.model group;cs:chronic stress.

組別Group糞便粒數(shù)(粒數(shù)/2 h)Amount of feces granules(n/2 h) 7 d d7 post－cs 15 d d15 post－cs 24 d d24 post－cs 29 d d29 post－cs 40 d d40 post－cs對照Control 2.86±3.64**2.14±2.03***2.80±2.64*0.50±1.38*1.75±1.92模型Model 7.33±4.25 9.33±2.89 5.09±2.11 2.71±2.86 2.36±2.74

2.3 慢性應激刺激對大鼠敞箱行為評分的影響

給予應激刺激后的早期(9 d和18 d)，模型組動物敞箱行為評分(包括水平運動得分和垂直運動得分)比對照組略有增高，但二者間沒有統(tǒng)計學差異。至應激27 d時，模型組動物敞箱行為評分顯著低于對照組(P＜0.05)。至應激40 d時，這種降低的趨勢仍然存在。如表4所示。

2.4 慢性應激對大鼠蔗糖水偏嗜度的影響

給予大鼠慢性應激刺激，可導致其興趣缺失，表現(xiàn)為模型組動物蔗糖水偏嗜度降低，其中造模20d時，模型組與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，如表5所示。

表4 慢性應激對大鼠敞箱行為評分的影響(±s，n=15)Tab.4 Effect of chronic stress on the scores of open－field test in the rats

表4 慢性應激對大鼠敞箱行為評分的影響(±s，n=15)Tab.4 Effect of chronic stress on the scores of open－field test in the rats

注:與模型組比較，*P＜0.05差異有顯著性。Note:*P＜0.05 significant difference vs.model group;cs:chronic stress.

組別Group水平運動得分Horizontal movement activity score垂直運動得分Vertical movement activity score 9 d d9 post－cs 18 d d18 post－cs 27 d d27 post－cs 40 d d40 post－cs 9 d d9 post－cs 18 d d18 post－cs 27 d d27 post－cs 40 d d40 post－cs對照Control 40.67±19.94 6.90±7.53 26.78±19.55*29.75±19.14 7.17±4.53 1.93±2.43 6.27±5.29*4.54±2.22*模型Model 43.46±22.73 8.45±9.16 9.00±9.27 15.00±9.03 7.38±5.19 2.80±5.28 2.42±2.64 2.27±2.28

表5 慢性應激對大鼠蔗糖水偏嗜度的影響(±s，n=15)Tab.5 Effect of chronic stress on the preference for sucrose water in the rats

表5 慢性應激對大鼠蔗糖水偏嗜度的影響(±s，n=15)Tab.5 Effect of chronic stress on the preference for sucrose water in the rats

注:與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05差異有顯著性。Note:*P＜0.05 significant difference vs.model group;cs:chronic stress.

組別Group蔗糖水偏嗜度Sucrose water preference(%)造模前Pre－cs 10 d d10 post－cs 20 d d20 post－cs 30 d d30 post－cs 40 d d40 post－cs對照Control 80.69±10.12 81.93±11.95 86.81±6.47*80.02±16.44 89.81±8.09模型Model 80.81±9.76 71.08±19.42 69.59±20.24 70.73±25.51 79.54±17.45

3 討論

IBS的發(fā)生與遺傳、早期生活經(jīng)歷、感染、腸道菌群失調(diào)及食物等多種因素有關(guān)，其發(fā)病機制尚未完全闡明?，F(xiàn)有的實驗動物模型主要是模擬IBS某些病理生理學特征，如腹瀉或便秘、疼痛等，或模擬某些致病因素建立動物模型，如模擬遺傳因素致病的轉(zhuǎn)基因動物模型、模擬早期生活經(jīng)歷致病的幼鼠母子分離孤養(yǎng)模型或幼鼠直腸擴張模型等，但轉(zhuǎn)基因動物價格昂貴且不易獲得，幼鼠模型造模時間長且實驗條件要求高、耗費大，均不宜用于大量藥物篩選。其他IBS動物模型如腸道感染模型、化學刺激誘導腸道炎癥模型以及藥物(如促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子，CRF)誘導的胃腸運動紊亂模型等，但這些誘發(fā)因素或條件刺激均與IBS發(fā)病的自然危險因素有較大差距［7～10］。因此建立與IBS自然發(fā)病因素更加吻合、更全面、準確再現(xiàn)IBS病理生理學特征，且操作簡便、經(jīng)濟適用的動物模型對于研究IBS的發(fā)病機制和相關(guān)藥物具有實際應用意義。

胃腸功能異常是IBS患者的主要臨床特征，在此基礎(chǔ)上，IBS患者還存在著明顯的精神心理的異常。研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，97.1%的IBS患者存在不同程度的心理問題。其中中度以上異常的有77.9%，重度異常的有57.4%［11］。因此IBS被認為是一種伴有神經(jīng)精神異常和胃腸道功能改變的生理心理疾病。

應激反應在IBS發(fā)生或加重過程中具有重要作用。病理性應激刺激可以激活中樞情感活動系統(tǒng)(emotion motor system，EMS)。EMS為中樞系統(tǒng)的一個網(wǎng)絡機構(gòu)，主要包括下丘腦室旁核、杏仁核、水管周圍灰質(zhì)，接受從內(nèi)臟和軀體以及從皮質(zhì)傳入的刺激信號，經(jīng)過信號整合后通過垂體和腦橋延髓核對自主神經(jīng)系統(tǒng)的輸出、神經(jīng)內(nèi)分泌以及內(nèi)臟感覺進行調(diào)節(jié)，產(chǎn)生胃腸道生理和病理征狀，例如IBS的形成。與此同時應激刺激又可導致焦慮、抑郁等精神異常［12］。

本研究對大鼠施以慢性不可預見性的應激刺激，以單位時間內(nèi)的動物排便粒數(shù)反映其胃腸道運動功能，以腹部回撤反應(AWR)壓力閾值反映動物內(nèi)臟敏感狀態(tài)，二者共同評價慢性應激刺激對動物胃腸道功能的影響。同時通過敞箱實驗和蔗糖水偏嗜度實驗評價動物神經(jīng)精神活動的改變，目的建立與臨床IBS患者癥狀相符的動物模型。

實驗結(jié)果顯示，給予大鼠慢性應激刺激后，模型組動物的AWR壓力閾值(疼痛壓力閾值和最大耐受壓力閾值)與對照組相比均明顯降低，表明應激刺激導致了動物內(nèi)臟感覺的增敏。這種變化在給予應激刺激第10天及第20天時即可明顯顯現(xiàn)，至第32天和第40天時，模型組動物的AWR壓力閾值仍保持低水平趨勢。排便實驗結(jié)果顯示，模型組動物排便粒數(shù)比對照組明顯增加，第7天時即與對照組有顯著差異，并持續(xù)至第29天，第40天時，模型組動物的排便數(shù)量雖仍高于對照組，但無統(tǒng)計學差異。上述結(jié)果顯示應激刺激所致內(nèi)臟感覺增敏和胃腸運動亢進與IBS患者出現(xiàn)的腹痛、腹部不適感覺及排便異常等臨床癥狀相吻合，且這種變化在遭受應激刺激的中早期(2～3周)表現(xiàn)明顯。

敞箱活動評分減少表明動物的探究能力或者好奇心理下降，蔗糖水偏嗜度降低反映動物快感缺失［5］。本實驗結(jié)果顯示給予大鼠慢性應激刺激后，模型組動物敞箱實驗的水平運動得分與垂直運動得分均顯著降低，蔗糖水偏嗜度也明顯降低，所反映出的活動能力下降、興趣喪失現(xiàn)象與臨床IBS患者的抑郁樣精神狀態(tài)相似，且這種變化在遭受應激刺激3～4周時表現(xiàn)明顯。

綜上所述，給大鼠施予慢性不可預見性的應激刺激導致其出現(xiàn)胃腸運動亢進、內(nèi)臟感覺增敏以及抑郁樣等狀態(tài)，與臨床上IBS患者的發(fā)病原因及癥狀表現(xiàn)相似。與現(xiàn)有動物模型相比，本模型的致病因素與現(xiàn)實社會IBS患者的自然致病因素更加吻合，且具有操作簡便、實驗周期短、經(jīng)濟易行等特點，可用于研究IBS的發(fā)病機制以及評價和觀察相關(guān)藥物的作用。

(本文圖1，2見封二。)

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Establishm ent and Evaluation of a Novel Rat M odel of Chronic Stress-Induced Irritable Bowel Synd rom e

FAN Jiang－bo，CHANG Hong－sheng，DONG Shi－fen，YAN Xing－li，WANG Jing，HONG Ying
(School of Traditional Chinese Pharmaceutics，Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100102，China)

ObjectiveTo establish a novel rat model of irritable bowel syndrome(IBS)by exposing to chronic unpredictable stressors.M ethods Thirty male SD rats were used in this study.The rats were exposed to chronic unpredictable stress with additional individual housing to induce IBS symptom.The stress factors include:drink prohibition，fasting for 24 hours，day and night reversal，cold，heat，pain，arrest and swing.Visceral sensation was assessed by pressure threshold of abdominal withdrawal reflex(AWR)，gastrointestinal motility was assessed by counting the feces granules.open－field test and fluid consumption test were performed to assess the neuropsychic function.Results Compared with the control rats，at 2 or 3 weeks post exposure，the visceral sensation and gastrointestinal motility of the model rats increased evidenced as the increased amount of faces granules and decreased pressure threshold of AWR.At 3 or 4 weeks post exposure，the scores of open－field test and the preference for sucrose solution was significantly reduced in the model rats as compared with those of the control rats.On the day 40 post exposure，all the above mentioned change trend still could be observed in the model group rats，but without statistical significance compared with those of the control rats..ConlusionBy exposing to the chronic unpredictable stress with additional individual housing，rats show the following changes:enhanced gastrointestinal motility，visceral sensation and changes of neuropsychic function，which are quite similar to the symptom of IBS patients，and may be used in related research in future.

Irritable bowel syndrome;Chronic unpredictable stress;Gastrointestinal motility;Visceral sensation; Neuropsychic function;Rat

R33

A

1005－4847(2010)02－0091－05

2009－09－23

國家自然科學基金項目(30572463);北京市重點實驗室(JD100260652)。

樊江波(1983－)，男，北京中醫(yī)藥大學碩士研究生，研究方向:中藥藥理學?，F(xiàn)工作于國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局。

洪纓，Tel:010－84738626，E－mail:yinghong2000@sina.com