蘭 欣

(青島職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化工學(xué)院,山東青島266555)

氰戊菊酯對牙鲆鰓細(xì)胞系體外的細(xì)胞毒性＊

蘭 欣

(青島職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化工學(xué)院,山東青島266555)

采用牙鲆鰓細(xì)胞系FG-9307,測定擬除蟲菊酯類農(nóng)藥氰戊菊酯的體外細(xì)胞毒性.細(xì)胞生長速度在測試質(zhì)量濃度5,10和15μg/mL顯著降低.此外,三種應(yīng)用比較廣泛的測試終點(diǎn)方法——中性紅吸收實(shí)驗(yàn)法、四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)法、細(xì)胞蛋白分析法被用于檢測氰戊菊酯的體外細(xì)胞毒性.實(shí)驗(yàn)證明三種測試方法的細(xì)胞毒性的相關(guān)性很高,并不因測試終點(diǎn)不同而不同.這說明FG細(xì)胞系有可能成為檢測氰戊菊酯體外細(xì)胞毒性的合適的生物指標(biāo).

氰戊菊酯;牙鲆鰓細(xì)胞系;體外細(xì)胞

水環(huán)境中的污染物對海洋生物甚至整個生態(tài)系統(tǒng)都是潛在的威脅.魚類急性試驗(yàn)是評估化學(xué)制品的水生生物毒性的常規(guī)方法.以前,大量的水體中化學(xué)制品的急性毒性數(shù)據(jù)來自成體魚的LC50實(shí)驗(yàn),即測定化學(xué)藥品作用一段特定的時間(通常指96h)的半致死濃度.然而,這種體內(nèi)實(shí)驗(yàn)成本高、費(fèi)時,且需要特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備.因此,需要建立快速有效的生物檢測方法來檢測化學(xué)制品的潛在毒性.Rachlin和Perlmutter(1968)首次提出將培養(yǎng)的魚類細(xì)胞系用于水體污染物的急性體外細(xì)胞毒性分析.Kocan等(1979),Marion和Denizeau(1983),Bols等(1985),Babich等(1986),Babich和Borenfreund (1987)[1,2],以及Saito等(1991)[3]運(yùn)用多種主要來源于淡水魚類的細(xì)胞系將體外細(xì)胞毒性分析法進(jìn)一步推廣.最近,源于Poeciliopsis lucidas的魚類肝細(xì)胞瘤的細(xì)胞系PLHC-1被Huuskonen等(1998)用于評價纖維素和木片提取物的急性細(xì)胞毒性.源于海水魚Paralichthys olivaceus的牙鲆鰓細(xì)胞系FG-9307被用于測定有機(jī)磷農(nóng)藥的體外細(xì)胞毒性(李紅巖等,2001;2002).

由于它的高殺蟲性以及對哺乳動物、鳥類等的低毒性和低環(huán)境殘留量(Giri等,2002;Vijveberg和Berckey,1990)[4],氰戊菊酯[(RS)-α-氰基-3-苯氧基芐基-(RS)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸酯],是一種合成擬除蟲菊酯類農(nóng)藥,廣泛用于農(nóng)業(yè)(Saito等,2000),因此成為一種可能導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)改變的長效水生污染物(Woin, 1998)[5].氰戊菊酯的殘留期為75～178天.氰戊菊酯在自然水體中對水生生物尤其魚類是危險(xiǎn)的(Rozanski,1992).氰戊菊酯的毒性被廣泛研究于哺乳動物(De Souza Spinosa等,1999;Giri等, 2002;Hadnagy等,1999;Mandhane和Chopde, 1997[6];Singh和Jha,1996)以及淡水魚類(Kamalaveni等,2001;Radhaiah和Rao,1990;Reddy等, 1991).然而,氰戊菊酯對海水魚類以及他們的培養(yǎng)細(xì)胞的毒性效應(yīng)知之甚少.在本研究中,FG-9307,一種來源于牙鲆Paralichthys O livaceus(童裳亮等, 1997)[7]的連續(xù)細(xì)胞系被用于氰戊菊酯的體外細(xì)胞毒性測定.

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和化學(xué)藥品

本實(shí)驗(yàn)所用連續(xù)細(xì)胞系FG-9307來源于牙鲆鰓.細(xì)胞在20℃的基本培養(yǎng)基(MEM,Gibco BRL, New York)中培養(yǎng),添加了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的小牛血清(BCS,Hyclone,Utah),100國際單位/mL的青霉素,100μg/mL的鏈霉素.

氰戊菊酯,Ⅱ型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥,使用含20%有效成分的乳化液.用此乳化液而不是化學(xué)純物質(zhì)是為了達(dá)到田間水平.乳化劑可以保護(hù)有效成分為離子態(tài),從而可降低毒性(Coats等,1989).小牛血清白蛋白(BSA),中性紅(NR),四唑鹽(MTT)均來自Sigma公司(StLouis,MO,USA).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氰戊菊酯對生長速度的影響

將匯合的細(xì)胞從25cm2培養(yǎng)瓶中收集,并用新鮮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基稀釋濃度至1×105個/mL.20000個細(xì)胞懸浮于200μL培養(yǎng)基加入96-孔板的每孔中,20℃孵育過夜.第二天棄去培養(yǎng)基,分別換上含0,5,10和15μg/mL氰戊菊酯的培養(yǎng)基.每個質(zhì)量濃度做三個平行樣.每天用童等(1997)[7]的原位計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞密度,以細(xì)胞數(shù)/mm2表示.

1.2.2 氰戊菊酯對細(xì)胞毒性分析

將匯合的細(xì)胞從25cm2培養(yǎng)瓶中收集,并用新鮮的含有10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基稀釋濃度至1×105個/mL.20000個細(xì)胞懸浮于200μL培養(yǎng)基加入96-孔板的每孔中,20℃孵育過夜.第二天,棄去培養(yǎng)基分別換上新鮮培養(yǎng)基(作對照)和含有不同濃度氰戊菊酯的培養(yǎng)基.每個濃度做三個平行樣.細(xì)胞培養(yǎng)48h后進(jìn)行毒性檢測.

1)中性紅(NR)吸收實(shí)驗(yàn)

方法參照Borenfreund和Puerner(1985)[2]檢測細(xì)胞生長所受的抑制,這是基于活細(xì)胞的溶酶體能夠吸收活體染料中性紅,而死細(xì)胞不能吸收這種染料的原理來進(jìn)行的.

①經(jīng)過48h的處理后,輕輕移去舊培養(yǎng)基,每孔加入200μL在20℃預(yù)熱過夜的含50μg/mL中性紅的培養(yǎng)基.

②20℃孵育3h.

③移去中性紅溶液,加上預(yù)熱至20℃的磷酸緩沖液輕輕沖洗.

④移去磷酸緩沖液,加入200μL解析液(冰醋酸◇質(zhì)量濃度96%乙醇◇水=1◇50◇49,體積比).

⑤室溫快速震蕩10min,用酶聯(lián)免疫儀在波長540nm處測定溶液的光吸收值.

⑥計(jì)算IC50值(即中性紅吸收被抑制50%的受試農(nóng)藥的濃度).

2)四唑鹽MTT檢測

參照Borenfreund等[2]的方法,基本原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞則無此功能.

①經(jīng)過48h的處理后,每孔加入20μLMTT的PBS溶液(MTT質(zhì)量濃度為5 mg/mL),20℃繼續(xù)培養(yǎng)4h;

②4h后,輕輕把溶液移去,加入預(yù)熱至20℃的PBS溶液,輕輕地快速漂洗2次;

③每孔加入150μL DMSO以溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物;

④用酶標(biāo)儀在波長為490 nm處測定其光吸收值,計(jì)算其I C50值.

3)細(xì)胞總蛋白含量測定(cell protein assay)

細(xì)胞蛋白分析采用Shopsis和Eng的方法,是檢測經(jīng)污染物處理后的細(xì)胞總蛋白含量的方法.

①氰戊菊酯處理48h后,輕輕移去舊培養(yǎng)基.

②細(xì)胞用溫PBS輕輕漂洗后,加入50μL 0.1 mol/L的NaOH溶液裂解細(xì)胞.

③96-孔培養(yǎng)板20℃放置1h.

以上所有的實(shí)驗(yàn)做3次,每一劑量的平均吸收值換算為對照組吸收值的百分比.

2 結(jié) 果

2.1 對細(xì)胞生長的抑制作用

當(dāng)FG-9307細(xì)胞暴露于氰戊菊酯中,它的生長速度在所有的3個測試質(zhì)量濃度中均被抑制,這是一個質(zhì)量濃度依賴過程.對照細(xì)胞培養(yǎng)48h后細(xì)胞密度為1.32×103個/mm2,經(jīng)5,10,15μg/mL氯氰菊酯處理的細(xì)胞經(jīng)48h培養(yǎng)后細(xì)胞密度分別為1.19×103,0.88×103,0.70×103個/mm2.生長曲線也說明細(xì)胞的生長被氰戊菊酯抑制(見圖1).

圖1 氰戊菊酯對FG細(xì)胞生長曲線的影響

2.2氰戊菊酯對細(xì)胞毒性分析

NR,MTT和細(xì)胞蛋白分析法測定的氰戊菊酯對細(xì)胞毒性結(jié)果都是相似的,不因所采用的細(xì)胞毒性測試終點(diǎn)方法不同而不同,見圖2.實(shí)驗(yàn)所用的最低質(zhì)量濃度的氰戊菊酯1μg/mL就對細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的毒性效應(yīng),并且毒性隨質(zhì)量濃度的增大而增大,呈現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性.從圖2計(jì)算了NR,MTT和細(xì)胞蛋白分析法的I C50值,即48h內(nèi)引起細(xì)胞毒性參數(shù)受抑制程度達(dá)到50%時的氰戊菊酯的質(zhì)量濃度,分別為15.68,16.49,16.66μg/mL.

圖2 氰戊菊酯對FG細(xì)胞體外細(xì)胞的毒性

3 討 論

氰戊菊酯可以濃度依賴方式抑制細(xì)胞的生長速度,由于細(xì)胞生長速度的計(jì)算容易操作,FG細(xì)胞是個方便快捷的體外檢測氰戊菊酯急性毒性的系統(tǒng).三種廣泛應(yīng)用的測試終點(diǎn)方法——NR,MTT,細(xì)胞蛋白分析法表明三種測試系統(tǒng)的細(xì)胞毒性的相關(guān)性很高,并不因測試終點(diǎn)不同而不同.這與Ekwall的觀點(diǎn)——當(dāng)用依賴于細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)和功能的不同測試終點(diǎn)檢測毒性時,大部分的細(xì)胞系對于毒物有類似的反應(yīng)是吻合的.三種反應(yīng)基于不同的毒性終點(diǎn),中性紅是基于溶酶體膜損傷,MTT分析反映了對線粒體酶的抑制,細(xì)胞蛋白含量的降低可反映對細(xì)胞生長的抑制.細(xì)胞生長是貼壁的,細(xì)胞死亡可由脫壁表示,因此細(xì)胞蛋白的減少可作為一個表示細(xì)胞死亡的數(shù)量指標(biāo)(Charles Shopsis和Ben Eng,1985).由于在氰戊菊酯的最低受試濃度1μg/mL對細(xì)胞就有毒性,這說明FG細(xì)胞對氰戊菊酯很敏感,FG細(xì)胞有可能成為檢測氰戊菊酯急性毒性的合適的生物指標(biāo).

據(jù)報(bào)道氰戊菊酯在濃度25μg/L時作用14天可使實(shí)驗(yàn)的鯉魚全部死亡,一種擬除蟲菊酯農(nóng)藥permethrin對魚類的LC50在0.001～0.01mg/L范圍內(nèi)(H.Lutnika,1999)[8].而本實(shí)驗(yàn)測得IC50值用NR,MTT和細(xì)胞蛋白分析法分別為15.68,16.49和16.66μg/mL.看來鰓上皮細(xì)胞是動物和它的水環(huán)境的重要屏障,因此是污染物的首要作用對象.體外魚類生態(tài)毒性評價方法的發(fā)展可促進(jìn)探測及篩選水污染物的能力.

本文是首次報(bào)道海水魚類細(xì)胞系用于氰戊菊酯的體外細(xì)胞毒性測定.

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I n Vitro Cytotoxicity of the Pyrethroid I nsecticide Fenvalerate to the Flounder(ParalichthysOlivaceus)Gill Cells

LAN Xin

(Department ofBiochemistry,Qingdao Vocational and Technology College,Qingdao Shandong 266555,China)

The FG-9307 cell line derived from the gill of flounder Paralichthys olivaceuswas used to determine the cytotoxic effects of the pyrethroid pesticide,fenvalerate in the present study.The cell growth rate was markedly reduced by fenvalerate at the concentrationsof 5,10 and 15μg/mL tested.In addition,threewidely used endpoint assays,NR,MTT and cell protein assays,showed that the in vitro cytotoxicity of fenvalerate was closely correlated in all the systems independent of the toxic endpoints employed.These make the gill cell line a good candidate for deter mining the acute in vitro cytotoxicity of fenvalerate.

fenvalerate,flounder gill cell line,in vitro Cell

book=9,ebook=379

Q 2

A

1673-2103(2010)05-0074-04

2010-05-16

國家科技部863項(xiàng)目(2001AA649040)

蘭欣(1977-),女,四川成都人,講師,碩士,研究方向﹕生物技術(shù)與分子營養(yǎng)學(xué).