王一存,蘇全平,槐艷艷,王 麗

(東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長春130024)

白色念珠菌天冬氨酸蛋白酶重組蛋白的表達(dá)及純化

王一存,蘇全平,槐艷艷,王 麗

(東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長春130024)

以白色念珠菌為實(shí)驗(yàn)材料,利用玻璃珠破碎法、PCR技術(shù)克隆白色念珠菌天冬氨酸蛋白酶基因,根據(jù)基因重組技術(shù)構(gòu)建Sap2原核表達(dá)載體,使之表達(dá)蛋白并且將目的蛋白純化.將獲得的Sap2蛋白免疫兔子,進(jìn)行Western blot分析,研究了白色念珠菌天冬酰胺蛋白酶的免疫學(xué)原性.

白色念珠菌;Sap2;原核表達(dá)載體;Western blot

0 引言

白色念珠菌(Candida albicans)是寄生于正常人口腔、上呼吸道、腸道及陰道的正常菌群,一般在正常機(jī)體中數(shù)量較少,不會引起疾病,但當(dāng)機(jī)體免疫功能下降或正常菌群相互制約作用失調(diào),白色念珠菌會大量繁殖并侵入深層組織,引起系統(tǒng)性白色念珠菌感染[1].

近年來白色念珠菌致病性的研究已取得了很大進(jìn)展,其中分泌性天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartyl proteinase,Sap)是近年來的研究熱點(diǎn),Sap產(chǎn)量高的白色念珠菌株對黏膜上皮細(xì)胞的粘附性比產(chǎn)量低的菌株高.天冬氨酸蛋白酶家族共包括10個家族成員Sap1～Sap10,分別由10個基因編碼[2-4].在感染進(jìn)展的不同階段白色念珠菌合成和分泌的Sap類型有所不同,當(dāng)侵入到機(jī)體深部或者血液系統(tǒng)時,合成和分泌的Sap2明顯高于其他成員.Sap2其相對分子量質(zhì)量為41000,能降解多種人體蛋白,去除宿主的防御屏障作用,有助于白色念珠菌的傳播,還能刺激細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子.

白色念珠菌SAP2基因沒有內(nèi)含子,本研究利用 PCR方法直接從白色念珠菌基因組中獲得SAP2序列,利用PET-28質(zhì)粒構(gòu)建雜合質(zhì)粒,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白含有組氨酸標(biāo)簽,可通過鎳柱純化重組蛋白,然后再檢測重組蛋白免疫動物的情況,為下一步研究Sap2的功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

E.coL iDH5α,E.coL iBL21,PET-28,白色念珠菌Candida albicans,均由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶EcoR I/Xho I,T4DNA連接酶,Taq DNA poLymerase購自 Takara公司;dN TP IPTG為Sigma公司產(chǎn)品,咪唑?yàn)锽BI公司產(chǎn)品.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白色念珠菌SAP2基因的提取

(1)白色念珠菌DNA的提取.離心收集1.5 mL過夜培養(yǎng)的菌體,將細(xì)胞懸浮于50μL STES緩沖液中,向其中加入等體積酸洗過的玻璃珠后每管加入20μL TE,再加入等體積混合的酚-氯仿60μL振蕩1 min.12000 r/min離心5 min,收集上清0℃乙醇沉淀15 min,4℃12000 r/min離心10 min,70%乙醇洗滌干燥15 min,40μL TE溶解,電泳檢驗(yàn)[5].

(2)PCR獲得目的序列.根據(jù)SAP2的序列設(shè)計引物,根據(jù)PET-28的酶切位點(diǎn)圖譜分析,內(nèi)側(cè)引物上游設(shè)計為EcoR I的酶切位點(diǎn)GAATTC,下游設(shè)計為Xho I的酶切位點(diǎn)CTCGAG.

外側(cè)上游引物:GTTGATTCCTCTTGGTTGA;

外測下游引物:TTTATTCCACCCCTTCATCTTA.

內(nèi)側(cè)上游引物:GCCGGAATTCCAAGCTGTCCCAGTGACTTT;內(nèi)側(cè)下游引物:GCCGCTCGAGGGTCAAGGCA GAAATACTGG.

PCR體系為:第一輪RCR反應(yīng)體系:ExTaq 12.5μL,外側(cè)上下游引物各1μL,白色念珠菌DNA3 μL,超純水7.5μL,依次按以下步驟操作:預(yù)變性94℃4 min,94℃1 min,53℃40 s,72℃1.5 min,30個循環(huán),72℃10 min.然后以第一輪PCR的反應(yīng)產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR,反應(yīng)體系為:ExTaq 12.5 μL,內(nèi)側(cè)上下游引物各1μL,模板2μL,超純水8.5μL,按照相同的條件進(jìn)行PCR反應(yīng),1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn),回收SAP2,并用Eco R I和Xho I雙酶切.

1.3.2 SAP2重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將PET-28菌種接入LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過夜,常規(guī)方法提取質(zhì)粒,37℃EcoR I和Xho I雙酶切3 h,1%瓊脂糖凝膠電泳證明酶切完全后,利用膠回收試劑盒回收完全切開的載體[6].

將經(jīng)過雙酶切的SAP2片段和載體片段以3∶1(體積比)的比例16℃過夜連接,形成SAP2和PET-28重組質(zhì)粒.

1.3.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

(1)感受態(tài)細(xì)胞的制備.從平板上挑取新活化的 E.coliDH5α單菌落,接種于4 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃條件下100 r/min振蕩培養(yǎng)過夜.取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入100 mL LB中,37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期D(600)≈0.5,將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中,冰上放置10 min.4℃條件下,5000 r/min離心10 min,棄上清.加入10 mL冰預(yù)冷的0.1 mol/L的CaCl2,用移液槍輕輕吹打,使細(xì)胞懸浮.然后4℃, 5000 r/min離心10 min,棄上清.再加入4 mL冰預(yù)冷的0.1 mol/L的CaCl2溶液,輕輕懸浮細(xì)胞.將制備的感受態(tài)細(xì)胞200μL加入50μL甘油,混勻,-80℃保存?zhèn)溆?E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞以同樣的方法制備并保存.

(2)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化.將連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中,用移液槍輕輕吹打均勻,置于冰上30 min, 42℃水浴熱激1.5 min,冰上放置1～2 min,然后加入800μL的LB培養(yǎng)基,150 r/min,37℃振蕩培養(yǎng)1 h.最后,3000 r/min離心5 min,扔掉部分上清,用移液槍輕輕吹打均勻,使細(xì)菌充分懸浮后均勻涂布于含 Kan的篩選平板上.37℃倒置過夜培養(yǎng).

1.3.4 重組質(zhì)粒的篩選鑒定

挑單克隆,接種于4 mL LB培養(yǎng)液中100 r/min 37℃過夜培養(yǎng),次日小量提取質(zhì)粒,用EcoR I、Xho I酶切后瓊脂糖凝膠電泳,初步鑒定為陽性克隆.篩選的陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序.

1.3.5 SAP2基因的誘導(dǎo)表達(dá)

用測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E.coliBL21.挑取單克隆保存菌液,并進(jìn)行重組蛋白的表達(dá).取20μL菌種,加入含100μg/mL Kan 4 mL的LB培養(yǎng)基中,100 r/min 37℃過夜培養(yǎng),以1∶100的比例(體積比)將上述菌液加入到含100μg/mL Kan的LB培養(yǎng)基中,200 r/min培養(yǎng)3 h,搖菌至D(600)≈1.0,加入IPTG至終濃度1 mmol/L分別誘導(dǎo)表達(dá)5 h.8000 r/min離心10 min,收集菌體,按照每毫升菌體加25μL 1×PBS進(jìn)行懸浮后SDS-PAGE電泳.考馬斯亮蘭染色以鑒定目的蛋白是否表達(dá).

1.3.6 Sap2蛋白的提取純化

將20 mmol/L PBS溶解菌體沉淀后,冰浴中超聲波破碎.將細(xì)菌破碎液以9000 r/min高速離心20 min,分別收集沉淀和上清液,SDS-PA GE電泳檢驗(yàn)?zāi)康牡鞍状嬖谟谏锨暹€是沉淀中.

8 mol/L尿素溶解沉淀,過夜,9000 r/min離心20 min,10 mL PBS洗鎳柱,鎳柱純化蛋白時取上清過柱,依次用20,40,100,200,500 mmol/L咪唑洗脫液5 mL洗脫并收集洗脫液,然后SDS-PAGE電泳檢驗(yàn),處理鎳柱子使其再生.將獲得的蛋白洗脫液加入到透析袋中,分別用6 mol/L尿素2 h,4 mol/L尿素2 h,2 mol/L尿素2 h,PBS 2 h進(jìn)行梯度透析.硅膠干燥濃縮.

1.3.7 Western blot鑒定Sap2的免疫原性

取健康兔子血清作為陰性對照后進(jìn)行兩次免疫,第一次注射1 mg Sap2蛋白,兩周后第二次注射0.5 mg Sap2蛋白,以免疫后的兔血清作為材料進(jìn)行Western blot檢驗(yàn).20μg Sap210%聚丙烯酰胺凝膠電泳,80 V電轉(zhuǎn)移3 h至PVDF上,印跡膜用5%(體積分?jǐn)?shù))脫脂牛奶4℃封閉過夜;1∶100(體積比)稀釋的兔血清37℃孵育1 h,TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min;1∶1000(體積比)稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h,TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min,AEC顯色.

2 結(jié)果

2.1 白色念珠菌總DNA的鑒定

提取純凈的白色念珠菌總DNA是合成高質(zhì)量SAP2的關(guān)鍵因素.1%瓊脂糖凝膠電泳證明,提取的白色念珠菌DNA質(zhì)量較好,具有單一的目的條帶,未見其他雜DNA污染條帶.紫外分光光度計分析表明DNA的純度較高,結(jié)果見圖1.

圖1 白色念珠菌的總DNA電泳圖

圖2 SAP2DNA片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 SAP2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

SAP2的引物在內(nèi)側(cè)引物下游添加Xho I的酶切位點(diǎn)CTCGAG,上游添加EcoR I的酶切位點(diǎn)GAATTC,以利于其正確插入載體.利用設(shè)計的引物進(jìn)行巢式PCR,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果表明在1000 bp附近有一條帶,片段大小與預(yù)計結(jié)果相符,見圖2.

2.3 PET-28-SAP2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

PET-28序列有EcoR I的酶切位點(diǎn)GAATTC和Xho I的酶切位點(diǎn)CTCGAG.將獲得的SAP2插入載體中,用此連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E.coL iDH5α菌,挑取菌落將菌落擴(kuò)增后提取質(zhì)粒,經(jīng)過EcoR I、Xho I雙酶切鑒定,結(jié)果與預(yù)測相符.

瓊脂糖凝膠電泳可見兩條帶,小片段在1000 bp附近,與SAP2的PCR產(chǎn)物位置相同,與預(yù)期的白色念珠菌SAP2基因片段大小一致.測序表明,原核表達(dá)質(zhì)粒PET-28-SAP2構(gòu)建正確,見圖3.

圖3 PET-28-SAP2雙酶切鑒定電泳圖

2.4 Sap2蛋白的表達(dá)及鑒定

原核表達(dá)質(zhì)粒PET-28-SAP2轉(zhuǎn)化BL21后,37℃條件下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、SDS-PAGE電泳、考馬斯亮蘭染色后發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化PET-28-SAP2的細(xì)菌表達(dá)的蛋白電泳中出現(xiàn)一條明顯的條帶.SAP2目的蛋白的相對分子質(zhì)量約為41000,融合蛋白的相對分子質(zhì)量應(yīng)該為41000左右,41000對應(yīng)的位置有與預(yù)期結(jié)果相符的條帶,表明融合蛋白表達(dá)成功.分別誘導(dǎo)1,2,3,4,5,6 h后收集菌體,經(jīng)過SDS-PAGE電泳可見誘導(dǎo)5 h蛋白表達(dá)量最高;分別以0,0.2,0.4,0.6,0.8,1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h,確定最佳誘導(dǎo)濃度為0.8 mmol/L,見圖4.

2.5 Sap2蛋白的純化

將超聲破碎后的裂解液離心,分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果證明沉淀中含有重組蛋白.所以重組蛋白是以包涵體和可溶性蛋白兩種形式存在的.

采用10倍鎳柱床體積的20 mmol/L咪唑洗柱,用20 mmol/L PBS配制的20,40,100,200,500 mmol/L咪唑洗脫液梯度洗脫,以獲得純度較高的融合蛋白.在100和200 mmol/L咪唑洗脫時獲得純度較高的蛋白,見圖5.

圖5 純化Sap2蛋白電泳圖

2.6 Werstern blot鑒定Sap2的免疫原性

AEC顯色可見免疫后的血清組在相應(yīng)的蛋白條帶位置出現(xiàn)了明顯的棕黃色條帶,而陰性對照組卻未出現(xiàn)條帶.Western blot結(jié)果表明,Sap2可刺激兔子產(chǎn)生特異的免疫反應(yīng),見圖6.

圖6 Werstern blot鑒定Sap2免疫原性圖

3 討論

免疫抑制劑、廣譜抗生素、抗腫瘤藥物的應(yīng)用及各種器官移植手術(shù)導(dǎo)致臨床真菌感染的發(fā)病趨勢發(fā)展迅速,而念珠菌是最常見條件致病真菌,其中白色念珠菌致病性最強(qiáng)、感染率最高,已經(jīng)成為威脅患者生命安全的重要因素.因此對于系統(tǒng)性白色念珠菌感染的檢測以及疫苗和抗真菌治療的研究有很高的應(yīng)用價值[7].目前真菌疫苗的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展,其中重組亞單位或者表位疫苗DNA是白色念珠菌疫苗研究的重點(diǎn).但目前缺乏有效的早期診斷和防治手段,該病仍具有較高的發(fā)病率和病死率.

本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上,利用巢式PCR從白色念珠菌DNA中克隆了SAP2序列,在引物中設(shè)計了不同的酶切位點(diǎn)可以使目的基因順利插入到載體中.從而構(gòu)建了能夠表達(dá)蛋白的表達(dá)質(zhì)粒PET-28-SAP2,重組質(zhì)?？稍谒拗骶懈咝П磉_(dá)目的蛋白.在克隆過程中,將構(gòu)建好的PET-28-SAP2轉(zhuǎn)入E.coliBL21,經(jīng)過不同時間的誘導(dǎo)表達(dá)后,我們初步確定Sap2蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最適條件為:IPTG誘導(dǎo)5 h.目的蛋白可以在非變性的條件下用鎳柱純化,而以包涵體形式表達(dá)的蛋白需在尿素溶解后復(fù)性才能用鎳柱純化,經(jīng)純化可以得到大量的純度較高的Sap2蛋白,為進(jìn)一步研究Sap2蛋白的生物學(xué)特性、免疫原性及其在白色念珠菌感染診斷和疫苗開發(fā)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[8].

經(jīng)過Western blot驗(yàn)證我們得到的純度較高的Sap2蛋白具有免疫原性,免疫的兔子血清中產(chǎn)生了抗體,這樣就可以純化血清中的抗體用于免疫治療以及白色念珠菌感染的早期診斷研究.

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[2] YANG QIONG,WANG LI,LU DA-NING,et al.Prophylactic vaccination with phage-displayed epitope ofC.albicanselicits protective immune responses against systemic candidiasis in C57BL/6 mice[J].Vaccine,2005,23(31):4088-4097.

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[7] 楊瓊,蘇全平,溫得中,等.系統(tǒng)性白色念珠菌感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)及疫苗研究進(jìn)展[J].生理科學(xué)進(jìn)展.2006.37(3):259-262.

[8] 楊瓊,蘇全平,溫得中,等.展示白色念珠菌HSP90的雜合噬菌體誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)[J].東北師大學(xué)報:自然科學(xué)版,2006,38(4):106-109.

(責(zé)任編輯:方 林)

Expression and pruification of protein Sap2 inE.coiL

WANG Yi-cun,SU Quan-ping,HUAI Yan-yan,WANG Li
(School of Life Sciences,Northeast Normal University,Changchun 130024,China)

Total DNA was isolated fromCandida albicans,their DNA fragment of SAP2 gene were gained by nested PCR.The highly conserved co-chaperone for SAP2 was cloned into a bacterial experssion vetor PET-28.And the Sap2 protein was produced inE.colicells when it was induced by IPTG.The protein would be verified by SDS-PAGE,purified by Ni-NTA,the expressed proteins were easily purified,Sap2 can be used to show antigenicity in animal immunization

Candida albicans;Sap2;prokaryotic expression vector;Western blot

R 392.11[學(xué)科代碼]180·37

A

1000-1832(2010)04-0111-05

2010-03-21

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30872365);吉林省科技發(fā)展計劃項(xiàng)目(20080939).

王一存(1985—),女,碩士研究生;王麗(1957—),女,博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要從事細(xì)胞生物工程研究.