徐紀(jì)蕓,潘奕陶,池振新,王 寧

(1.東北師范大學(xué)城市與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,吉林長春130024; 2.中石油東北煉化工程有限公司吉林設(shè)計(jì)院,吉林吉林132001; 3.吉林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院環(huán)境科學(xué)系,吉林長春130012; 4.大連東泰產(chǎn)業(yè)廢棄物處理有限公司,遼寧大連116600)

汞對中國林蛙蝌蚪的毒性效應(yīng)

徐紀(jì)蕓1,2,潘奕陶3,池振新4,王 寧1

(1.東北師范大學(xué)城市與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,吉林長春130024; 2.中石油東北煉化工程有限公司吉林設(shè)計(jì)院,吉林吉林132001; 3.吉林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院環(huán)境科學(xué)系,吉林長春130012; 4.大連東泰產(chǎn)業(yè)廢棄物處理有限公司,遼寧大連116600)

為深入探討汞對兩棲類動物的致毒作用和機(jī)理,將中國林蛙(Rana chensinensis)蝌蚪暴露于含Hg2+的曝氣自來水中,統(tǒng)計(jì)得出24,48,72和96 h的半致死濃度(LC50)分別為1.048,0.849,0.609和0.488 mg/L,并計(jì)算得出安全濃度(SC)為0.167 mg/L.另外,將26～27期林蛙蝌蚪飼養(yǎng)在Hg2+質(zhì)量濃度分別為10,20,30和40μg/L的曝氣自來水中,染毒40 d,分兩時段測定其體內(nèi)汞的含量,24 h蝌蚪體內(nèi)的汞含量表現(xiàn)為染毒初期出現(xiàn)多個富集高峰,10 h后逐漸下降并穩(wěn)定;每隔5 d的采樣測定結(jié)果表明,隨染毒時間延長,蝌蚪體內(nèi)總汞含量總體呈下降趨勢.染毒30 d后,各染毒組蝌蚪體內(nèi)總汞含量基本穩(wěn)定,且各染毒組蝌蚪體內(nèi)總汞的平衡含量接近.蝌蚪急慢性汞中毒實(shí)驗(yàn)表明,汞污染對林蛙種群的正常生長有極大的負(fù)面影響.

汞;中國林蛙蝌蚪;毒性

0 引言

汞是自然界中一種有毒重金屬元素,是動物體內(nèi)的非必需元素,具有極強(qiáng)的生物累積作用,即使是低濃度的汞,一旦進(jìn)入水環(huán)境中也可通過水生食物鏈的富集作用,使魚體內(nèi)的汞含量嚴(yán)重超標(biāo)[1-2],并直接威脅到人類的健康.近些年來,隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重,兩棲動物種類、數(shù)量在世界各地急劇下降[3],人們對于兩棲動物的關(guān)注程度也在不斷加大.兩棲類動物具有獨(dú)特的生活習(xí)性和生命周期,卵和蝌蚪期在水中生活,成體的生境則位于接近水的陸地.兩棲類的皮膚具有較高的滲透性,對污染物的累積作用明顯,因此對水體污染非常敏感,尤其是在幼體發(fā)育階段對毒物有較好的響應(yīng)作用,是毒理學(xué)研究的理想材料之一[4].

中國林蛙(Rana chensinensis)是一種營養(yǎng)價值極高的經(jīng)濟(jì)蛙類,廣泛分布于以長白山地區(qū)為主的我國東北各省.目前,有關(guān)重金屬對中國林蛙蝌蚪的毒性研究多集中在鎘和銅的毒性效應(yīng)方面[5],而對汞的研究尚未見報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)以中國林蛙的蝌蚪為對象,分別研究了其體內(nèi)汞的急性中毒和慢性中毒效應(yīng),為深入探討汞對兩棲類動物的致毒機(jī)理、反映研究區(qū)域環(huán)境質(zhì)量狀況提供了科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

(1)氯化汞(HgCl2):優(yōu)級純,北京金星化工廠生產(chǎn),用去離子水配制成1 mg/L母液;(2)硝酸(HNO3):優(yōu)級純,北京化工廠生產(chǎn);(3)硫酸(H2SO4):優(yōu)級純,北京化工廠生產(chǎn);(4)五氧化二釩(V2O5):分析純,上?？曝S化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn).

1.2 急性毒性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)材料:林蛙受精卵,采集于吉林省豐滿區(qū)旺起鎮(zhèn)附近水域.實(shí)驗(yàn)室孵化,孵化期間室溫為17℃～19℃.林蛙蝌蚪由受精卵發(fā)育到26～27期[6],約15日齡.適應(yīng)3 d后選取體質(zhì)健康、大小相似的個體進(jìn)行實(shí)驗(yàn),平均體重(0.068±0.01)g,平均體長(1.90±0.24)cm.實(shí)驗(yàn)期間,水溫18℃～21℃,p H值保持在6.8～7.0.

參考有關(guān)研究資料進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)[7-9].設(shè)3～5個間隔較大的 Hg2+濃度,觀察24,48和96 h蝌蚪的死亡數(shù)量,確定正式實(shí)驗(yàn)的濃度范圍.正式實(shí)驗(yàn)設(shè)8個實(shí)驗(yàn)組,Hg2+的質(zhì)量濃度分別為0.2,0.4,0.6,0.8, 1.0,1.2,1.4,1.6 mg/L及相應(yīng)的空白對照.實(shí)驗(yàn)用水為曝氣3 d以上的自來水,用2 L的燒杯,每個燒杯中隨機(jī)放10只蝌蚪,設(shè)3個平行組.為保證染毒濃度的穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)采取靜態(tài)-更新的方法[10],每12 h換水一次.為減少食物對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,實(shí)驗(yàn)期間禁食.及時觀察,記錄蝌蚪中毒癥狀,并隨時清除死亡個體.

用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算 Hg2+在24,48,72,96 h的半致死濃度(LC50),采用如下公式計(jì)算安全濃度SC值[11]:

其中:ρSC為安全濃度SC值,單位mg/L;ρ48hLC50為24 h半致死濃度LC50值,單位mg/L;ρ48hLC50為48 h半致死濃度LC50值,單位mg/L.

1.3 慢性毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)相關(guān)研究資料[9,12],設(shè)置Hg2+質(zhì)量濃度分別為10,20,30和40μg/L的4個染毒組,1個對照組.將蝌蚪飼養(yǎng)在直徑為30 cm的圓形魚缸內(nèi),每組投放300只蝌蚪,用5 L曝氣3 d以上的自來水飼養(yǎng).實(shí)驗(yàn)過程中,每2 d換1次水并同時加藥.用人工配制的合成飼料(玉米面、豆面、山野菜、維生素、動物油等按一定比例混合而成)喂養(yǎng),每日喂食1次.實(shí)驗(yàn)過程分為兩個時段,各組分別取15只蝌蚪測定總汞含量,實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行40 d.樣品采用V2O5-HNO3-H2SO4法消解后,立即用AFS-2202型原子熒光光度計(jì)測定其總汞含量(濕重).原始數(shù)據(jù)利用SPSS,Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 林蛙蝌蚪急性毒性實(shí)驗(yàn)

1.2 mg/L和1.4 mg/L染毒濃度組蝌蚪在染毒4 h后即表現(xiàn)出明顯中毒癥狀,蝌蚪的活動性減弱,多沉于燒杯底部,對外界刺激反應(yīng)遲鈍.染毒12 h后高于0.6 mg/L的濃度組部分蝌蚪游動時不能保持平衡,出現(xiàn)尾部彎曲和腹部膨大等中毒癥狀.

由表1中數(shù)據(jù)可見,蝌蚪的死亡率隨著 Hg2+濃度的增大和時間的延長而不斷升高.用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算Hg2+在24,48,72,96 h的半致死濃度(LC50)分別為1.048,0.849,0.609和0.488 mg/L,SC為0.167 mg/L.對水中 Hg2+濃度和林蛙蝌蚪死亡率進(jìn)行回歸分析,得出 Hg2+濃度和林蛙蝌蚪的死亡率呈線性相關(guān),結(jié)果見表2.

急性毒性實(shí)驗(yàn)一般不能反映環(huán)境污染物對水生生物長時間作用的結(jié)果,但由于急性實(shí)驗(yàn)時間短,能確定化學(xué)物質(zhì)的毒性程度和劑量-效應(yīng)關(guān)系,提供毒作用模式等方面的資料,并為進(jìn)一步開展其他毒性試驗(yàn)提供理論依據(jù),因此急性毒性實(shí)驗(yàn)得到了廣泛的應(yīng)用.盧祥云、張燕萍等人研究了汞離子和銅離子對中華大蟾蜍蝌蚪的聯(lián)合毒性[7],結(jié)果是汞離子對蝌蚪的24,48 h的LC50值分別為0.712,0.612 mg/L,汞離子和銅離子共存時對蝌蚪的24,48 h的LC50值分別為0.550～0.400 mg/L和0.379～0.300 mg/L.根據(jù)汪學(xué)英等人的研究[9],重金屬離子對黑斑蛙蝌蚪的毒性大小依次為Hg2+>Cu2+>Cd2+>Cr6+>Pb2+,其中Hg2+的毒性最強(qiáng),對黑斑蛙蝌蚪24 h和48 h的LC50值分別為0.77,0.75 mg/L.本次實(shí)驗(yàn)中Hg2+對中國林蛙蝌蚪的24 h和48 h LC50值分別為1.048,0.849 mg/L,說明中國林蛙蝌蚪對汞的抗性能力較中華大蟾蜍蝌蚪和黑斑蛙蝌蚪強(qiáng),這可能與不同物種的生理特征、原生活環(huán)境的差異及實(shí)驗(yàn)物種所處發(fā)育階段有關(guān).蝌蚪的死亡率隨著Hg2+濃度升高和染毒時間延長而升高,說明Hg2+在蝌蚪體內(nèi)存在累積效應(yīng),Hg2+毒性隨著蝌蚪體內(nèi)汞的蓄積量增加而增加.

表1 中國林蛙蝌蚪染毒Hg2+的死亡數(shù)和死亡率

表2 水中Hg2+濃度與林蛙蝌蚪死亡率的回歸分析

另外,黃敏毅等人研究了鎘對中國林蛙蝌蚪的毒性影響[13],結(jié)果是Cd2+對林蛙蝌蚪的24,48,72, 96 h的LC50值分別為5.72,5.15,3.67,3.10 mg/L.本實(shí)驗(yàn)Hg2+對中國林蛙蝌蚪的24,48,72,96 h的LC50值分別為1.048,0.849,0.609,0.488 mg/L,說明汞對中國林蛙蝌蚪的毒性要遠(yuǎn)大于鎘,對生物的危害性更大.

2.2 林蛙蝌蚪慢性毒性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 汞對林蛙蝌蚪生長發(fā)育的影響

分別用10,20,30和40μg/L Hg2+對林蛙蝌蚪染毒40 d,染毒組和對照組蝌蚪均有50%～60%的個體處于尾退化期[6].染毒30～35 d后,20,30,40μg/L染毒組蝌蚪個體開始出現(xiàn)明顯的發(fā)育畸形現(xiàn)象,包括尾基部彎曲(見圖1a),后肢著生在尾部一側(cè)(見圖1b),前肢短小,著生位置靠后等(見圖1c);特別是在變態(tài)后期40μg/L處理組蝌蚪大量畸形變態(tài),無法正常上岸活動.

圖140μg/L染毒組蝌蚪畸形變態(tài)

一直以來,汞都被懷疑是一種對生物機(jī)體危害極大的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì).環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)具有類天然激素或抑制天然激素的作用,可干擾神經(jīng)、免疫及內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常調(diào)節(jié)功能.兩棲類在幼體向成體轉(zhuǎn)變過程中伴隨著一系列腺體結(jié)構(gòu)的改變以及生理機(jī)能的變化,包括呼吸系統(tǒng)的改變、皮膚的滲透、排泄、分泌等,因此各種內(nèi)分泌干擾物容易在它們體內(nèi)富集并達(dá)到一個較高的濃度.這些都會直接或間接影響蝌蚪的發(fā)育,最終導(dǎo)致發(fā)育畸形.

2.2.2 蝌蚪體內(nèi)的汞含量分析

實(shí)驗(yàn)分兩個時段測定蝌蚪體內(nèi)的汞含量.首先在染毒后24 h內(nèi),分別取1,2,3,4,6,8,12,24 h的各組蝌蚪15只,測定其體內(nèi)總汞含量(濕重),分析蝌蚪對毒物的應(yīng)急反應(yīng),結(jié)果見表3.

表3 染毒24 h內(nèi)不同染毒濃度組蝌蚪體內(nèi)汞含量隨時間變化 mg/kg

從表3數(shù)據(jù)可見:①隨染毒濃度增大,蝌蚪體內(nèi)汞含量出現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢;②隨染毒時間延長,各濃度組蝌蚪體內(nèi)的汞含量呈波動變化,20μg/L以上濃度組蝌蚪體內(nèi)汞含量出現(xiàn)兩個或多個峰值,40μg/L染毒組蝌蚪體內(nèi)汞含量明顯高于其他染毒組,且峰值波動較大;③染毒初期出現(xiàn)多個富集高峰,10 h后逐漸下降并穩(wěn)定.低濃度染毒組蝌蚪體內(nèi)汞的富集高峰值出現(xiàn)在染毒后3 h,高濃度染毒組蝌蚪體內(nèi)汞的富集高峰值出現(xiàn)在4～6 h,有滯后現(xiàn)象;40μg/L染毒組在染毒12 h后下降到染毒初期的濃度,其他染毒組均在10 h后降到染毒初期的濃度.

第二時段,每隔5 d取各組蝌蚪15只,測定其體內(nèi)總汞含量,結(jié)果見表4和圖4.

表4 不同染毒濃度組蝌蚪體內(nèi)總汞含量隨時間變化 mg/kg

圖2 不同染毒濃度組蝌蚪體內(nèi)總汞含量隨時間變化曲線

從表3和表4可見,30和40μg/L染毒實(shí)驗(yàn)組蝌蚪從染毒24 h到第5天,體內(nèi)汞的含量仍在繼續(xù)上升,第15天后才迅速下降(見圖2);10和20μg/L染毒組蝌蚪體內(nèi)汞的含量也在緩慢上升,20 d后其體內(nèi)濃度才逐漸下降;染毒30 d后,各濃度組蝌蚪體內(nèi)汞含量基本穩(wěn)定,蝌蚪對汞的吸收富集量和代謝排除量已基本達(dá)到平衡.

2.2.3 蝌蚪對污染物汞的中毒途徑與作用機(jī)理探討

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[15],重金屬可通過以下三種途徑進(jìn)入水生動物體內(nèi):一是經(jīng)鰓直接吸收,然后通過血液輸送到全身各個部位;二是通過食物鏈經(jīng)消化道吸收[14];三是重金屬通過生物體表與水體的滲透交換作用進(jìn)入.

本實(shí)驗(yàn)中,染毒24 h后蝌蚪體內(nèi)汞含量迅速升高.推測經(jīng)鰓直接吸收和體表與水的滲透交換作用是其大量進(jìn)入蝌蚪體內(nèi)的兩個主要途徑.重金屬進(jìn)入生物體內(nèi)后,主要通過體表吸附和透過體表吸收兩種方式在體內(nèi)累積賦存[15].無機(jī)汞主要聚積于肝臟和腎臟,并能誘導(dǎo)肝和腎內(nèi)金屬硫蛋白的合成.大部分無機(jī)汞是通過肝、腎代謝隨尿液和膽汁排除體外的,而殘余在體內(nèi)的汞通過與金屬硫蛋白結(jié)合被隔離固定,在生物體內(nèi)蓄積.

各染毒濃度組蝌蚪體內(nèi)汞含量在染毒10 h后迅速下降,說明大部分無機(jī)汞被排出體外;但在染毒第1天到第5天又有小幅上升,最終趨于穩(wěn)定且平衡時的汞含量相差不大,說明蝌蚪體內(nèi)殘存的是與金屬硫蛋白結(jié)合的結(jié)合態(tài)汞.當(dāng)金屬硫蛋白的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和后,過量的未與金屬硫蛋白結(jié)合的游離態(tài)汞會與生物體內(nèi)其他的含巰基的蛋白質(zhì)結(jié)合,導(dǎo)致蝌蚪體內(nèi)某些酶類活性下降甚至失活;另外,汞也可通過與氨基、羥基、磷酸基結(jié)合與堿基等核酸組分絡(luò)合,破壞DNA的結(jié)構(gòu)完整性[16-17],這也是導(dǎo)致蝌蚪發(fā)育畸形(見圖1)的又一重要原因.

本課題組2007—2009年每年4月,在松花江上游葦沙河流域金礦開采區(qū)附近河流設(shè)置了7個水質(zhì)斷面,水樣中總汞含量為13～26μg/L[12].每年4-5月正值林蛙繁殖期,因此這一時期水體中汞的含量對蝌蚪的影響最大.本實(shí)驗(yàn)中10和20μg/L兩個低濃度染毒組蝌蚪對水體中汞的最大濃縮系數(shù)分別為488.2和272.6.在實(shí)驗(yàn)室條件下,由于汞具有較強(qiáng)的揮發(fā)性,水中的汞濃度會隨染毒時間的延長而逐漸降低.當(dāng)水中汞濃度較低時,汞的相對揮發(fā)量很小,但對于蝌蚪的富集仍存在一定的影響.自然條件下,一定時期內(nèi)水中的汞濃度基本上是穩(wěn)定的,所以蝌蚪對水中汞的富集系數(shù)可能還會更高.可見汞污染對于林蛙種群的正常繁衍將產(chǎn)生極大的影響.雖然受實(shí)驗(yàn)條件限制,但本實(shí)驗(yàn)中10和20μg/L兩個低濃度染毒組中國林蛙蝌蚪對水體中汞的富集規(guī)律以及汞對其生長發(fā)育產(chǎn)生的生理及形態(tài)影響,對研究汞污染地區(qū)的環(huán)境質(zhì)量,探討汞對兩棲類的影響仍具有十分重要的指導(dǎo)意義.

3 結(jié)論

(1)將中國林蛙蝌蚪暴露于含Hg2+的曝氣自來水中,蝌蚪在24,48,72和96 h的半致死濃度(LC50值)分別為1.048,0.849,0.609,0.488 mg/L,安全濃度(SC值)為0.167 mg/L.說明蝌蚪的死亡率隨著Hg2+質(zhì)量濃度的增大和時間的延長而不斷升高,且蝌蚪出現(xiàn)尾部彎曲和腹部膨大的中毒癥狀.

(2)蝌蚪慢性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:隨染毒時間延長,蝌蚪體內(nèi)汞含量總體呈現(xiàn)下降趨勢.染毒30 d后基本達(dá)到穩(wěn)定,且各染毒組蝌蚪體內(nèi)汞的含量非常接近,說明當(dāng)蝌蚪對汞的吸收量和代謝排除量達(dá)到平衡后,其體內(nèi)汞含量基本不隨外界汞含量的變化而變化.

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(責(zé)任編輯:方 林)

Toxic effects of mercury on Rana chensinensistadpole

XU Ji-yun1,2,PAN Yi-tao3,CHI Zhen-xin4,WANG Ning1
(1.College of Urban and Environmental Sciences,Northeast Normal University,Changchun 130024,China; 2.Petro China Northeast Refining&Chemical Engineering Co.Ltd.,Jilin Design Institute,Jilin 132001,China; 3.College of Environmental and Resources,Jilin University,Changchun 130012,China; 4.Dalian Dongtai Industrial Waste Treatment Co.,Ltd.,Dalian 116600,China)

In this thesis,Rana chensinensistadpole was exposed toHg2+-containing tap water to research the effect and mechanism of mercury toxicity on the amphibian furtherly.The result showed that the half lethal concentration(LC50)of 24,48,72 and 96 h were 1.048,0.849,0.609,0.488 mg/L respectively and the safe concentration(SC)was 0.167 mg/L.In addition,theRana chensinensis tadpoles of the stage 26～27 were feed in tap water under Hg2+concentration(10,20,30 and 40μg/L) for 40 d.The mercury concentrations of tadpoles determined in two-stage showed that during 24 h there were several concentration peaks when early exposured and gradually decreased and stabilized after 10 h;The result determined every 5 d showed that with the exposure time increasing,the mercury concentrations of tadpoles appeared the trend of gradually declining.The total mercury concentrations in each group of exposured tadpoles were in basic stabilization after 30 d and the balanced concentrations were similar.The test of acute and chronic mercury poisoning in tadpoles showed that mercury pollution has a great negative impact on normal development ofRana chensinensisspecies.

mercury;Rana chensinensis;tadpole toxicity

X 171.5[學(xué)科代碼]610·1020

A

1000-1832(2010)04-0138-06

2010-07-12

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(40673059);東北師范大學(xué)測試基金資助項(xiàng)目.

徐紀(jì)蕓(1983—),女,碩士研究生;通訊作者:王寧(1952—),女,博士,教授,主要從事環(huán)境物質(zhì)地表過程及生態(tài)效應(yīng)研究.