賈 磊,聶秀娟,方 梅,張 俊

(1.黃山學院 體育系,安徽 黃山 245041;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院,蘭州 730070)

黃參多糖對小鼠骨骼肌自由基代謝及超微結(jié)構(gòu)的影響

賈 磊1,聶秀娟1,方 梅2,張 俊1

(1.黃山學院 體育系,安徽 黃山 245041;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院,蘭州 730070)

通過超氧化物歧化酶 (SOD)活性、丙二醛 (MDA)含量和超微結(jié)構(gòu)的變化研究了黃參多糖 (SGP)對小鼠骨骼肌自由基代謝的影響。數(shù)據(jù)顯示,游泳+SGP各劑量組安靜時SOD活性是對照組的兩倍左右,力竭運動后即刻組比對照和單純運動的都高,且差異顯著,24h后恢復也快,并有明顯的量效關(guān)系,以劑量150-200mg·kg-1最佳。同時超微結(jié)構(gòu)還表現(xiàn)出,對照組力竭運動后由于自由基的攻擊出現(xiàn)了線粒體膜損壞,甚至有空泡化。還有肌絲松散、Z帶彎曲等病理現(xiàn)象的產(chǎn)生。而灌服SGP的各組小鼠無這類現(xiàn)象,并有肌糖原積累、線粒體增多的證實。這全面顯現(xiàn)出SGP對清除自由基,保護細胞膜,延緩疲勞,提高運動能力的作用。

黃參多糖;超氧化物歧化酶 (SOD);丙二醛 (MDA);骨骼肌;超微結(jié)構(gòu)

黃參屬傘形科迷果芹屬的迷果芹 (Sphallerocarpus gracilis),多年生草本,根塊狀或圓錐形,可食。民間用全草入藥,可以祛風除濕,主治風濕性關(guān)節(jié)痛等癥[1]。因根部黃色,形似參,人們一直稱其為黃參,常制成禮品饋贈親友?，F(xiàn)研究分析表明,黃參根部含有大量的糖分,約占總重的80%,非糖部分含有甾體及其甙、黃酮及其甙、α-細辛醚和有機酸,這些成分具有抗氧化、提高免疫、降血脂、保肝等多種生理功能[2]。為了研究黃參多糖對提高運動能力、延緩疲勞的作用,我們開展了此項研究。實驗證實,黃參多糖(Sphallerocarpus gracilis polysaccharides,SGP)對運動時能量補充及激發(fā)糖代謝和能量代謝酶系活性有積極作用,并能對小鼠骨骼肌自由基代謝和超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生深刻影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

取清潔級昆明種2月齡小白鼠180只 (購自甘肅省醫(yī)學科學研究院實驗動物中心),體重20±2g,雌雄各半。隨機分為對照組、單純游泳組和游泳+SGP組 (黃參多糖組,灌服用量分別為50、100、150、200 mg·kg-1)。對照組、單純游泳組和不同劑量組中每組又有三小組,即力竭運動前處死安靜組、力竭游泳后即刻組和力竭游泳后24h恢復組,每小組10只。

1.2 黃參多糖

從山丹祁連山北麓海拔2600m處采集野生黃參,取洗凈晾干的肉質(zhì)根2000g于60℃烘制4小時,取出置干燥器冷卻,然后打成粗粉,加水煎提,用95%乙醇沉淀,用sevag法脫蛋白,醇析,丙酮洗滌,抽干,得灰褐色粗多糖SGP-1。將水煮的殘渣用1.5%的氫氧化鈉冷浸三次,過濾,用蒸餾水透析,用上法脫蛋白、醇析等處理得灰褐色粗堿溶多糖SGP-2。經(jīng)測,SGP-1主要為葡萄糖,SGP-2含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸 (此方法已申請國家發(fā)明專利,申請?zhí)枮?006101047142)。合并SGP-1和SGP-2為SGP,供實驗用。

1.3 小鼠游泳實驗

實驗各組小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)2d后,游泳+SGP組每天按一定劑量SGP灌喂 (SGP按劑量用生理鹽水稀釋,以0.5ml/20g灌喂),對照組和單純游泳組按等量生理鹽水灌喂,連續(xù)3周。除對照組外,其它各組每天進行一次游泳鍛煉,第一天30min,然后每天增加10min,從第六天開始,每天80min;放在塑料桶里,水深約40cm,水溫20℃。第21天做力竭游泳 (包括對照組),標準是將小鼠放入水中開始記時,鼻部時露時沒入水中立即撈出。力竭游泳后即刻組立即斷頭處死,恢復組在力竭游泳后24h處死。

1.4 SOD和MDA的測定

小鼠斷頭后取左腿骨骼肌,用4℃生理鹽水洗去血污,每項測定稱取0.1g濕組織,加入5ml 0.2mol/L的Tris-HCI緩沖液,p H7.3,研磨成勻漿,然后以10000r/min于4℃下離心機離心20min,取上清液,分別采用相關(guān)測試盒 (均購自南京建成生物工程研究所)進行測定。

1.5 骨骼肌電鏡觀察

取各組小鼠右腿骨骼肌5×5mm3組織塊置于2%戌二醛固定液中,在4℃固定1-2h,然后用緩沖液反復洗滌2-3h(中間換液3次),再加入1%鋨酸固定2h,經(jīng)緩沖液沖洗3次,每次15min,各級酒精充分脫水,環(huán)氧樹脂(Epon-812)包埋,超簿切片機切片,鈾鉛染色。透射電鏡觀察、照相。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件作統(tǒng)計學處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 (±s)表示,用t檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 黃參多糖 (SGP)對小鼠骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)的影響

表1 黃參多糖 (SGP)對小鼠骨骼肌SOD活性的影響 U/L

黃參多糖 (SGP)對小鼠骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)的影響見表1。對照組力竭運動后即刻骨骼肌SOD含量明顯低于運動前安靜時水平,差異顯著,力竭后24h恢復組與即刻組相比仍有所下降,但無統(tǒng)計學意義。(此時只剩7只小鼠,3只在力竭游泳后死亡。)

單純游泳組力竭運動前安靜時SOD活性略高于對照組,說明通過鍛煉,清除自由基酶的活力增強。但力竭后SOD活力顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義 (P<0.05),且24h后幾乎沒有多少恢復,差異無統(tǒng)計學意義。

灌服SGP各劑量組小鼠骨骼肌SOD活性明顯高于對照組,差異顯著。力竭運動后即刻組、灌服 SGP各劑量組SOD活性均比單純運動組高,同時有一定量效關(guān)系,以劑量150—200mg·kg-1效果較好。

力竭游泳后24h恢復組中,單純游泳組小鼠骨骼肌中SOD恢復得很慢,同時顯著低于運動前。而灌服SGP各組小鼠的骨骼肌中SOD恢復較快,都接近運動前水平,同時存在量效關(guān)系。

2.2 黃參多糖 (SGP)對小鼠骨骼肌中丙二醛 (MDA)含量的影響

表2 黃參多糖 (SGP)對小鼠骨骼肌 (MDA)含量的影響 nmol/L

黃參多糖 (SGP)對小鼠骨骼肌中丙二醛 (MDA)含量的影響見表2。對照組力竭后即刻MDA含量幾乎是運動前的三倍,力竭后24hMDA含量仍在上升 (此時統(tǒng)計數(shù)字只有7只小鼠的,3只力竭運動后死亡)。

單純游泳組力竭運動前MDA略低于對照組,說明通過鍛煉過氧化產(chǎn)物能得到及時清除。但單純游泳組力竭運動后即刻MDA含量顯著升高 (P<0.01),24h后繼續(xù)上升,且顯著高于運動后即刻組 (P<0.01)。

灌服SGP各劑量組骨骼肌MDA含量均低于對照組,差異有的無統(tǒng)計學意義 (P>0.05),有的有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。存在一定的量效關(guān)系,以高劑量黃參多糖組150—200mg·kg-1對MDA抑制率較高。

力竭運動后24h,除單純游泳組MDA含量顯著高于對照組,也高于即刻組,差異具有顯著性外,灌服SGP的各劑量組都低于運動后即刻組,接近力竭前安靜組水平。

2.3 黃參多糖 (SGP)對小鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的影響

SGP對小鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的影響見下圖。圖1顯示的是小鼠骨骼肌正常結(jié)構(gòu),肌纖維清晰可辨。肌纖維可分成許多肌節(jié),每個肌節(jié)有明暗帶相間的橫紋。肌纖維的周圍有一層結(jié)締組織 (肌內(nèi)膜),肌內(nèi)膜中有肌漿網(wǎng)、線粒體和膠原纖維等。圖2圖3顯示對照組小鼠力竭運動后,骨骼肌受到運動的強烈刺激,在氧自由基的作用下,骨骼肌超微結(jié)構(gòu)受到破壞,出現(xiàn)了部分“肌絲松散”和“Z帶彎曲”的現(xiàn)象。圖4則表示對照組小鼠力竭游泳后線粒體膜損傷,甚至出現(xiàn)空泡化。這些結(jié)果與脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多是正相關(guān)的。

圖1 對照組小鼠力竭游泳前骨骼肌縱切10000×,示正常結(jié)構(gòu)

圖2 對照組小鼠力竭游泳后即刻骨骼肌縱切10000×,示肌絲松散

圖3 對照組小鼠力竭游泳后即刻骨骼肌縱切10000×,示Z帶彎曲

圖4 對照組小鼠力竭游泳后即刻骨骼肌縱切6600×,示線粒體有空泡化現(xiàn)象

圖5 游泳+SGP(劑量150mg·kg-1)組小鼠力竭游泳后骨骼肌縱切15000×,示線粒體增多

圖6 游泳+SGP(劑量150mg·kg-1)組小鼠力竭游泳后骨骼肌縱切10000×,示肌糖原增多

圖5圖6是灌服SGP高劑量組的小鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)。圖中可見,骨骼肌超微結(jié)構(gòu)不但沒有出現(xiàn)“肌絲松散”和“Z帶彎曲”的現(xiàn)象,而且明顯表現(xiàn)出線粒體和肌糖原增多。這不僅直接從組織學給黃參多糖有助于小鼠肌糖原增多和供氧能力增強提供了科學依據(jù),而且也全面顯現(xiàn)出SGP在清除自由基、保護細胞膜、延緩疲勞和提高運動能力方面的作用。

3 討論

在正常情況下,人體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài),自由基的濃度很低,不會引起傷害。但是,當過度訓練或受物理、化學因素刺激后,體內(nèi)自由基就會增多,使自由基產(chǎn)生與清除之間的平衡狀態(tài)被破壞,結(jié)果自由基的濃度超過了傷害的“閾值”,導致蛋白質(zhì)、核酸、多糖和膜脂分子的氧化破壞,血液流變、呼吸等生理過程的改變和心臟、肺臟、肌肉、胃等器質(zhì)性傷害[3]。特別是膜脂中的多不飽和脂肪酸雙鍵最易受自由基的攻擊發(fā)生過氧化作用,過氧化過程會產(chǎn)生新的自由基,從而促進膜脂的過氧化,膜的完整性受到破壞,使細胞內(nèi)組分大量外漏,最后導致細胞傷害甚至死亡。

現(xiàn)代研究表明,運動疲勞的產(chǎn)生與氧自由基 (·OH)代謝有關(guān),這是因為強運動刺激可引起氧自由基過剩。脂質(zhì)過氧化是氧自由基損傷組織的重要方式之一,其損傷途徑是氧自由基攻擊細胞膜使膜脂過氧化形成過氧化脂質(zhì),再進一步分解產(chǎn)生丙二醛 (MDA)。因此,MDA可作為細胞被氧自由基傷害的定量指標,其含量越高,脂質(zhì)過氧化程度也越高[4-8]。而超氧化物歧化酶 (SOD)能特異地、有效地清除氧自由基,阻止細胞膜的脂質(zhì)過氧化,所以在研究運動對自由基代謝影響時常用這兩種物質(zhì)的消漲作為參考。

有研究表明,耐力訓練能提高機體抗氧化酶活性[9-13],保護細胞的完整性及生理功能[14],這與本實驗單純游泳組與對照組的結(jié)果是一致的。但這種作用是有限的,采用灌服SGP+游泳,則可使小鼠骨骼肌中SOD活性明顯升高,且MDA含量顯著降低,并存在一定的量效關(guān)系,尤其是劑量在150—200mg·kg-1之間的效果較好,其SOD活性是對照組的2.3倍,MDA含量則降低了 7%。證明黃參多糖(SGP)能有效激發(fā)SOD酶基因的表達,使SOD活性隨運動強度的增加而升高,并且提高了對膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的清除能力,阻止了對細胞膜的進一步脂質(zhì)過氧化,對延緩疲勞的發(fā)生和提高運動能力具有積極意義。

同時,本實驗還從小鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的變化上證實了黃參多糖 (SGP)對清除氧自由基、防止膜破壞方面的作用。當小鼠沒有經(jīng)過游泳鍛煉而進行力竭運動時,骨骼肌中線粒體膜破壞嚴重,有的甚至出現(xiàn)空泡化 (圖4),肌絲出現(xiàn)排列松散和Z帶扭曲等一系列損傷 (圖2和圖3)。這是運動能力降低,疲勞產(chǎn)生,乃至無法恢復的機理所在。因為線粒體是生物氧化、產(chǎn)生能量的主要場所,三羧酸循環(huán)、呼吸鏈上的電子傳遞以及磷酸化都在線粒體膜上進行[15-17],其釋放的高能磷酸鍵 (ATP)提供做功的能量,包括肌肉收縮[18-19]。一旦自由基過剩,首先遭攻擊破壞的就是線粒體膜,從而導致供能不足,疲勞產(chǎn)生,運動能力下降,進一步則可引起肌纖維的損傷,從實驗的圖2、圖3和圖4中也得到證實。而灌服黃參多糖 (SGP)組的小鼠,尤其是劑量達到150mg·kg-1,隨著SOD活性升高,清除氧自由基能力增強,細胞膜得到有效保護,肌纖維和線粒體都沒有異化現(xiàn)象出現(xiàn),相反卻是線粒體增多,肌糖原積累增加 (圖5、圖6),大大提高了供能效果,增強了肌肉收縮做功的能力。這一切都表現(xiàn)出黃參多糖 (SGP)對影響骨骼肌氧自由基代謝、提高運動能力有著重要作用。

綜上所述,實驗證實黃參多糖 (SGP)能有效地激發(fā)SOD酶基因的表達,使SOD活性隨運動強度的增加而升高,并且提高了對膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的清除能力,阻止了對細胞膜的進一步脂質(zhì)過氧化,對延緩疲勞的發(fā)生和提高運動能力具有積極意義。并且,實驗還從小鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的變化上證實了黃參多糖 (SGP)對清除氧自由基、防止膜破壞方面的作用。所以可以證實,黃參多糖 (SGP)對清除自由基、保護細胞膜、延緩疲勞和提高運動能力等方面均有著積極的作用,是一種很有潛能的運動營養(yǎng)補劑。

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Effect of Sphallerocarpus Gracilis Polysaccharides on Muscular Free Radical Metabolism and Ultrastructure in Mice

JIA Lei1,NIE Xiu-juan1,FANG Mei2,ZHANGJun1
(1.Department of Physical Education,Huangshan University,Huangshan 245041,China;2.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

By the experiment of activity of SOD,the content of MDA and the changes of muscular ultrastructure,the effect of Sphallerocarpus gracilis polysacchorides(SGP)on muscular free radical metabolism in mice was investigated.The results showed the activity of SOD of all mice in swimming plus SGP groups was twice as much as the control group before swimming rest,and it was conspicuously higher than the control group and the swimming group after exhaustive exercise.The recovery was quick after 24 hours.Therefore,these results indicated SGP had significant close-effect in mice,especially 150-200mg·kg-1dose-effect was the best.Meanwhile,in muscular ultrastructure,the results showed mitochondrial membrane of mice in control group had been damaged after exhaustive exercise by attacked of free radical,especially the phenomenon of vacuolization had emerged.And the pathological phenomenon of looseness of myofilament and bend of Z band had appeared.But these phenomena had not appeared on all mice which were infused through mouth by SGP.Furthermore,the study showed SGP could increase the content of MGand mitochondria.So the study totally manifested the function of SGP on removing free radical,protecting membrane,delaying fatigue and improving exercise ability.

Sphallerocarpus gracilis polysacchorides(SGP);superoxide dismutase(SOD);malondialdehyde(MDA);skeletal muscle;ultrastructure

G804.7

:A

:1008-3596(2010)05-0058-05

2010-03-22

安徽省教育廳自然科學項目 (KJ2009B274Z);黃山學院引進人才啟動項目資助 (2008xskq013)

賈 磊 (1971-),男,湖南岳陽人,博士,副教授,研究方向為運動分子生物學及運動生理學。