李文惠,趙 斌,閆萬軍

不同負(fù)荷間歇負(fù)重跑訓(xùn)練對老齡大鼠骨骼肌MG29蛋白的影響

李文惠,趙 斌,閆萬軍

目的:研究不同負(fù)荷負(fù)重跑訓(xùn)練對老齡大鼠骨骼肌內(nèi)MG29蛋白(Mitsugumin29)表達(dá)的影響,探尋衰老性肌肉丟失(Sarcopenia)及其可訓(xùn)練性的機(jī)理。方法:32只17月齡的雄性Wistar大鼠被隨機(jī)分為較大負(fù)荷運(yùn)動組(HG)、中等負(fù)荷運(yùn)動組(MG)和較小負(fù)荷運(yùn)動組(L G)和對照組(CG),運(yùn)動組各鼠分別負(fù)重其最大負(fù)荷的30%、50%和60%進(jìn)行跑臺訓(xùn)練8周,每周6次,周日休息,每次跑2 min,間隔2 min為1組,共訓(xùn)練6組。每周稱量所有大鼠體重,8周后取材,光鏡下觀測骨骼肌的一般形態(tài),測定各鼠股直肌中段的勻漿脂褐質(zhì)濃度、鈣濃度,并采用Western Blot法測定股直肌中段的MG29蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論:1)較小或中等強(qiáng)度的間歇負(fù)重跑運(yùn)動對于延緩老齡大鼠骨骼肌的衰老來說是比較適宜的運(yùn)動刺激,它能夠有效提高骨骼肌內(nèi)MG29蛋白的表達(dá)水平,從而使骨骼肌維持正常的興奮收縮偶聯(lián)結(jié)構(gòu),并促進(jìn)胞外鈣流入,從而保持或增強(qiáng)骨骼肌的正常收縮功能,相對降低細(xì)胞內(nèi)的自由基水平,從而延緩了因衰老所致肌肉萎縮、丟失。2)較大強(qiáng)度的間歇負(fù)重跑運(yùn)動是不適宜的運(yùn)動刺激,該強(qiáng)度下運(yùn)動使MG29蛋白水平減低,可能使骨骼肌的收縮功能減弱,且骨骼肌內(nèi)的自由基水平顯著升高,脂褐質(zhì)大量蓄積。

衰老;衰老性肌肉丟失;鈣穩(wěn)態(tài);MG29蛋白;負(fù)重跑;鼠;動物實(shí)驗(yàn)

骨骼肌組織是有機(jī)體內(nèi)最復(fù)雜的組織之一,人類成年后,隨著年齡的增長,骨骼肌的功能和結(jié)構(gòu)便逐漸發(fā)生退行性變化(Sarcopenia)[32],這也加速了心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)分泌等其他各器官系統(tǒng)的衰老[16,38]。因此,研究骨骼肌的衰老問題也是延緩整個機(jī)體衰老的重點(diǎn),只有使骨骼肌維持正常的興奮收縮耦聯(lián)功能,才有助于其他器官功能的正常發(fā)揮。

骨骼肌的肌漿膜垂直內(nèi)陷入肌纖維形成了橫管系統(tǒng),橫管系統(tǒng)與其兩側(cè)的縱管系統(tǒng)(即肌漿網(wǎng)在靠近橫管處的膨大部分)共同構(gòu)成的復(fù)合機(jī)構(gòu)又被稱為三聯(lián)管,三聯(lián)管和肌漿網(wǎng)共同作為骨骼肌內(nèi)興奮收縮耦聯(lián)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),對骨骼肌的功能發(fā)揮起著關(guān)鍵作用[2]。Mitsu gumin 29 (MG29)蛋白是新發(fā)現(xiàn)的位于三聯(lián)管復(fù)合結(jié)構(gòu)的橫管膜上的小分子蛋白[25],學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn),該蛋白對三聯(lián)管和肌漿網(wǎng)的早期發(fā)育[19]以及成年后正常形態(tài)的維持[29]均起重要作用。研究發(fā)現(xiàn),MG29蛋白與骨骼肌衰老關(guān)系密切[5],衰老大鼠骨骼肌中的MG29蛋白與正常青年鼠相比減少了約50%[26],Zhao[39]等人將正常青年鼠的MG29蛋白基因敲除,MG29缺失的青年鼠的骨骼肌出現(xiàn)了類似衰老鼠的特征,如肌力衰退,易疲勞,以及電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)的三聯(lián)管結(jié)構(gòu)和功能的嚴(yán)重破壞:橫管系統(tǒng)腫脹,肌漿網(wǎng)出現(xiàn)空泡或者碎裂,鈣火花的動態(tài)活性降低,出現(xiàn)隔離的鈣池等。因MG29蛋白的氨基酸序列類似突觸素[26],學(xué)者們推測該蛋白可能對橫管系統(tǒng)和肌漿網(wǎng)間的信號傳導(dǎo)起重要作用,研究表明,該蛋白可直接調(diào)控興奮收縮耦聯(lián)的關(guān)鍵蛋白I型蘭諾丁受體(RYR1),因而,促使肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣離子釋放入胞漿,增強(qiáng)肌肉收縮功能,同時,該蛋白也能夠探測肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣儲存,具有當(dāng)肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣濃度降低時,調(diào)動肌細(xì)胞外的鈣流入胞漿以補(bǔ)充虧空的鈣庫的功能[24]。

諸多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了Sarcopenia肌肉的可訓(xùn)練性[23,34],但其內(nèi)在機(jī)理尚須探討,運(yùn)動訓(xùn)練與老齡肌肉的MG29蛋白表達(dá)之間是否有相關(guān)性,其相關(guān)性如何,目前尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。本研究旨在探尋不同參數(shù)的間歇負(fù)重跑運(yùn)動訓(xùn)練與老齡骨骼肌的MG29蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性,探討運(yùn)動干預(yù)Sarcopenia問題的可能機(jī)制,從而為后續(xù)進(jìn)行運(yùn)動抗衰老的研究提供新的思路和科學(xué)依據(jù),為延緩衰老提供理論依據(jù),并期望為老年人進(jìn)行健身鍛煉提供指導(dǎo)和理論依據(jù),為延長個人健康壽命和推動整個社會的進(jìn)步盡綿薄之力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

17月齡的雄性Wistar健康大鼠32只,平均體重500～520 g,均為清潔級,由河北省動物實(shí)驗(yàn)中心提供。大鼠購回后在河北師范大學(xué)體育學(xué)院動物房內(nèi)進(jìn)行分籠飼養(yǎng),每籠4只,室溫控制在22℃±2℃,相對濕度45%～55%,每天自然光照,自由飲水?dāng)z食,動物飼料選用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物混合飼料,飼養(yǎng)籠墊料使用高壓滅菌消毒墊料,每周更換2次,飼料和墊料亦由河北省動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

大鼠購回后適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,稱量體重,隨機(jī)分為4組,每組8只,各組間動物的體重?zé)o顯著性差異(表1)。

表1 本研究實(shí)驗(yàn)動物分組情況一覽表Table 1 G roups of the Animals (只)

1.2 訓(xùn)練方法

1.無負(fù)重適應(yīng)性訓(xùn)練1周,所有運(yùn)動組大鼠參加,在跑臺上進(jìn)行跑速為10 m/min,每天30 min的適應(yīng)性訓(xùn)練,跑臺坡度設(shè)置為0°。

2.負(fù)重適應(yīng)性訓(xùn)練1周,所有運(yùn)動組大鼠參加,在跑臺上進(jìn)行跑速為10 m/min,每天30 min的負(fù)重適應(yīng)性訓(xùn)練,跑臺坡度設(shè)置為0°,負(fù)重形式采用在大鼠的腰背部綁縛條形負(fù)荷(圖1),負(fù)重量為其最大負(fù)重的10%,其最大負(fù)重的獲取參考Bedford等和閆萬軍[13]等人的方法,在大鼠的腰背部施加重物,逐級增加重量,直至其不能正常站立行走,將此時的負(fù)重確定為其最大負(fù)重強(qiáng)度。

圖1 施加負(fù)荷方式圖Figure 1 The Load-exerted Mode

圖2 跑臺訓(xùn)練圖Figure 2 T readmill T raining

3.正式負(fù)重跑訓(xùn)練8周。所有運(yùn)動組大鼠在跑臺上進(jìn)行為期8周的正式負(fù)重跑訓(xùn)練,跑臺設(shè)置為跑速15 m/ min,坡度0°,以跑2 min,休息2 min為1組,共訓(xùn)練6組,每日1次,周日休息,共訓(xùn)練8周;對各鼠施加的負(fù)重量是通過預(yù)實(shí)驗(yàn)獲取各鼠的最大負(fù)重,再通過計算其百分比來確定(表2)。

表2 本研究各運(yùn)動組大鼠負(fù)重占其最大負(fù)重比一覽表T able 2 The Exerted Loads for the EGs Taking the Percentage of Their Maximum Bearing Loads(%)

4.對于安靜對照組(CG)的所有大鼠,令其正常飲水?dāng)z食,不施加任何運(yùn)動干預(yù)。

1.3 取材

在正式負(fù)重跑訓(xùn)練的第8周末,最后一次運(yùn)動之后,所有大鼠禁食、禁水12 h,稱量體重后進(jìn)行取材。對各鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉,劑量為50 mg/ kg體重,待翻正反射消失后,解剖大鼠,取左側(cè)中段股直肌,去除脂肪,在4℃冰水中清洗,用濾紙吸干表面水分,液氮凍干后,放入-80℃冰箱保存,待測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)的測試

1.4.1 測量體重和觀察一般指標(biāo)

每周測量大鼠的體重,每天記錄攝食量,同時觀察大鼠的毛色,精神狀態(tài)和行為等外觀變化。

1.4.2 骨骼肌的形態(tài)學(xué)指標(biāo)

組織學(xué)方法在臨床醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域占有十分重要的地位,在光學(xué)顯微鏡下能夠直觀地了解衰老肌細(xì)胞的特征。肌組織蘇木精和伊紅染色(HE染色)是重要的肌組織染色方法,可將肌細(xì)胞的胞漿染為紅色,將細(xì)胞核染為藍(lán)紫色,從而能夠在光學(xué)顯微鏡下清晰地觀察肌細(xì)胞的一般形態(tài)[1]。

本實(shí)驗(yàn)取適量骨骼肌組織,制作常規(guī)冰凍橫切片后,進(jìn)行HE染色,具體操作步驟:1)將蘇木精0.5 g,硫酸鋁胺0.3 g和50%乙醇100 ml混合后加熱,至開始沸騰后取氧化汞0.6 g,每次少量加入,再沸騰20 min,冷卻后放置一夜,過濾后保存。使用時每20 ml原液中加入硫酸鋁胺飽和溶液80 ml稀釋;2)染色時將載玻片放入蘇木精液中10 min后,水洗5～10 min,再放入1%伊紅溶液中30 s～1 min,經(jīng)乙醇脫水后用加拿大樹脂封片;3)使用OL YMPUS CX21光學(xué)顯微鏡分別在放大100倍、200倍和400倍時觀察每張切片,使用Leica IM50 image manager V1.20分析軟件對所選視野進(jìn)行抓圖、存儲。

1.4.3 骨骼肌的勻漿指標(biāo)

1.勻漿脂褐質(zhì):脂褐質(zhì)是不飽和脂肪酸過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的分解物,細(xì)胞排泄不出,隨年齡增長在體內(nèi)積聚而增多,被作為組織衰老的重要標(biāo)志物,常用其在組織中的沉積量來判別組織的衰老程度[37]。在本實(shí)驗(yàn)中分別取300 mg左右凍存的骨骼肌組織塊,勻漿后采用熒光比色法[37],使用F-4500熒光分光光度計測定各樣本脂褐質(zhì)(LF)的含量。

2.勻漿鈣:鈣是神經(jīng)興奮和肌肉收縮之間的重要耦聯(lián)因子,肌漿內(nèi)的鈣含量能夠直接反應(yīng)肌肉的收縮功能[14]。本實(shí)驗(yàn)采用甲基百里香酚藍(lán)比色法,使用紫外分光光度計測定勻漿肌組織中的鈣含量,以期間接反映肌漿內(nèi)的鈣量變化。具體操作步驟按照試劑盒的說明進(jìn)行。

3.MG29蛋白:本實(shí)驗(yàn)中MG29蛋白在骨骼肌內(nèi)的表達(dá)水平采用蛋白免疫印跡法(Western Blot)進(jìn)行測試,具體測定方法:1)抽提蛋白:在20 mg冷凍肌組織中加入蛋白裂解液后,于冰上勻漿使蛋白充分裂解,而后離心10 min,將離心后的上清-20℃凍存;2)檢測蛋白濃度:按照BCA蛋白定量試劑盒的使用說明操作;3)Western Blot:分電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色/曝光6個步驟,下文詳述;4)使用Lab Works軟件對圖像進(jìn)行灰度分析,并用Image J軟件將灰度值數(shù)字化;5)以靶蛋白的灰度值除以內(nèi)參β-actin的灰度值,從而校正誤差,其結(jié)果即為該樣品靶蛋白的相對含量。

Western Blot的具體操作步驟:1)電泳:分別配制濃度為10%～12%的分離膠和濃度為4%的濃縮膠,加入凝結(jié)劑TEMED,灌膠,待膠凝固。上樣,開始電泳,濃縮膠電壓為80 V,分離膠電壓為120 V,待溴酚藍(lán)電泳至膠底部時終止電泳;2)轉(zhuǎn)膜:使用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜約45～90 min將靶蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,轉(zhuǎn)膜完畢后放入TBS-T中洗5 min;3)封閉:用TBST配制5%脫脂奶粉,將膜浸入后,室溫放置1 h;4)一抗孵育:用封閉液將一抗稀釋后將膜與一抗一起孵育,4℃過夜。孵育結(jié)束后用TBS-T洗3次,每次5 min; 5)二抗孵育:用封閉液稀釋以HRP標(biāo)記的二抗(Santa cruz)后,將稀釋后的二抗與膜共同孵育2～3 h。孵育結(jié)束,TBS-T洗3次,每次5 min;6)顯色/曝光:用DAB顯色試劑盒經(jīng)適當(dāng)顯色后,用水終止顯色;使用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液曝光。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計:結(jié)果數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD))表示,使用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總和繪圖,使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計分析,多組間數(shù)據(jù)如方差齊就進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA),若有顯著性差異則用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行比較。CG組與運(yùn)動組的比較則采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P<0.05為具有顯著性差異,P<0.01為非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 老齡大鼠的一般行為表現(xiàn)及其體重變化

大鼠在購回后,精神狀態(tài)良好,飲食積極,毛色稍有發(fā)黃,并伴有不同程度的脫毛現(xiàn)象。訓(xùn)練初期運(yùn)動組大鼠的飲食積極性稍差,隨著時間的推移,其飲食量漸漸增加,乃至明顯超過對照組。MG和HG組大鼠在每次訓(xùn)練間歇期和訓(xùn)練后均出現(xiàn)不同程度的疲勞現(xiàn)象,尤以HG組為甚,表現(xiàn)為運(yùn)動間歇時呼吸急促,俯臥于跑臺,不愿活動,但次日再訓(xùn)練時已恢復(fù)正常;L G組鼠的疲勞表現(xiàn)則不明顯,部分大鼠在運(yùn)動間歇時站立、張望、繼續(xù)活動。訓(xùn)練后,運(yùn)動組大鼠的精神狀態(tài)明顯好于CG組,表現(xiàn)為自主活動較多,對外界刺激的反應(yīng)更敏感。訓(xùn)練前,各組大鼠的體重?zé)o顯著性差異,但經(jīng)過8周的訓(xùn)練,與訓(xùn)練前相比,L G、MG和HG組的體重顯著降低,其中,HG組最為明顯(P< 0.01)。與訓(xùn)練前相比,安靜組大鼠的體重明顯增長,訓(xùn)練后各組對比,運(yùn)動組的體重均顯著低于CG組(表3)。整個訓(xùn)練過程中,各組大鼠的體重變化曲線如下:

圖3 本研究各組大鼠訓(xùn)練前、后體重變化曲線圖Figure 3 Curve of the Changing Weights Throughout the T raining

2.2 骨骼肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化

2.2.1 前人前期研究結(jié)果:青老對比

在光學(xué)顯微鏡下觀察老齡鼠的骨骼肌細(xì)胞形態(tài),可發(fā)現(xiàn)老齡鼠的肌細(xì)胞趨向于圓形,且細(xì)胞核有向細(xì)胞中央移動的趨勢,此外還有一些小的呈角狀的纖維[6]。本課題組成員[4,13]等對比成年鼠和老齡鼠在光鏡下的形態(tài)學(xué)特征,也證實(shí)了上述:在光鏡下觀察正常成年鼠的骨骼肌組織,肌纖維細(xì)胞膜清晰,呈多邊形,各個肌纖維大小均勻,且排列致密、整齊,其細(xì)胞核位于細(xì)胞邊緣的肌內(nèi)膜處;衰老鼠的肌纖維大小不一,排列不齊,細(xì)胞間隙增大,中間有白色組織填充,部分肌纖維呈現(xiàn)圓形化,細(xì)胞核出現(xiàn)中心化。

2.2.2 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),各組老齡大鼠的肌纖維均出現(xiàn)不同程度的圓形化現(xiàn)象,細(xì)胞大小不一,排列不齊,且細(xì)胞間隙加大,中間有白色組織填充。4組對比,以CG組最為明顯,HG組次之,L G和MG組的肌纖維較之其他兩組排列更緊密。MG組和HG組的部分肌細(xì)胞的直徑較大。

表3 本研究各組大鼠訓(xùn)練前、后體重比較一覽表T able 3 Comparison of the Weights before and after the Training±SD)(單位:g,各組n=8)

表3 本研究各組大鼠訓(xùn)練前、后體重比較一覽表T able 3 Comparison of the Weights before and after the Training±SD)(單位:g,各組n=8)

注:＊P<0.05,＊＊P<0.01,與訓(xùn)練前相應(yīng)組對比;▲P<0.01,★P<0.05,與訓(xùn)練后對照組對比。＊P<0.05,＊＊P<0.01,Compared with the corresponding groups before the training;▲P<0.01,★P<0.05, Compared with CG after the training.

CGL GMGHG訓(xùn)練前Before the Training431.50±20.16440.00±37.81448.75±33.57447.50±31.51訓(xùn)練后After the training442.00±31.89＊426.67±33.20＊▲430.00±32.86＊★427.25±39.33＊＊▲

1.光學(xué)顯微鏡下將HE染色樣本切片放大100倍時觀察(圖4)。

2.將HE染色樣本切片放大200或400倍時觀察(圖5)。

2.3 股直肌勻漿脂褐質(zhì)含量的測定結(jié)果與分析

過量的自由基是細(xì)胞和組織的危險殺手,它引起機(jī)體損傷,使不飽和脂肪酸氧化成超氧化物,形成脂褐質(zhì)。因機(jī)體細(xì)胞排泄不出該分解物,所以,隨著年齡的增長,脂褐質(zhì)在體內(nèi)慢慢積聚而增多。脂褐質(zhì)常常被作為組織衰老的重要標(biāo)志物,研究者們常用其在組織中的沉積量來判別衰老程度[37]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示,對照組(CG)和較大負(fù)荷運(yùn)動組(HG)的股直肌的脂褐質(zhì)濃度相比,無明顯差異,較小負(fù)荷運(yùn)動組(L G)和中等負(fù)荷運(yùn)動組(MG)的脂褐質(zhì)濃度亦無顯著差異,但CG組和HG組的脂褐質(zhì)沉積均顯著高于LG組和MG組(表4)。

2.4 股直肌勻漿鈣濃度的測定結(jié)果

肌肉收縮時調(diào)用鈣的能力直接反映肌肉的功能,隨著年齡的增長,肌肉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,使老齡肌肉更多地依賴胞外鈣進(jìn)行收縮[36],本實(shí)驗(yàn)測定的靜息狀態(tài)下的勻漿肌肉的鈣含量是有機(jī)體分配給骨骼肌的總鈣量,是肌細(xì)胞內(nèi)外鈣量的總和。在本實(shí)驗(yàn)中,研究結(jié)果顯示,運(yùn)動組各老齡鼠股直肌的鈣濃度均高于對照組(CG),尤其是較小負(fù)荷運(yùn)動組即L G組的鈣濃度升高得尤為明顯(表5)。

圖4 HE染色樣本組織切片圖Figure 4 Samples of HE Staining×100

圖5 HE染色樣本組織切片圖Figure 5 Samples of HE Staining

表4 本研究股直肌脂褐質(zhì)濃度測定結(jié)果一覽表(單位:μg/g,各組n=8)Table 4 Results of Lipofuscin Detection of Msculi Rectus Femoris

表5 本研究股直肌鈣濃度測定結(jié)果一覽表±SD)(單位:nmol/gprot,n=8)Table 5 Concentrations of Calcium

表5 本研究股直肌鈣濃度測定結(jié)果一覽表±SD)(單位:nmol/gprot,n=8)Table 5 Concentrations of Calcium

注:＊P<0.05,與CG組相比,＊＊P<0.01,與CG組相比;#P<0.05,與MG組相比;★P<0.05,與HG組相比。＊P<0.05,Compared with the CG,＊＊P<0.01,Compared with the CG; #P<0.05,Compared with the MG;★P<0.05,Compared with the HG.

CGL GMGHG鈣含量18.06±2.89 25.83±6.01＊＊#★22.50±5.5222.67±4.59＊

2.5 股直肌MG29蛋白表達(dá)的測定結(jié)果

MG29蛋白是維持骨骼肌三聯(lián)管膜結(jié)構(gòu)的重要蛋白,對胞外的鈣流入起著重要的正性調(diào)控作用。老齡肌肉的功能衰退可能與MG29蛋白減少有關(guān),適宜負(fù)荷的運(yùn)動能不能刺激該蛋白的表達(dá)水平呢?本實(shí)驗(yàn)采用Western Blot法測試其表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)中,股直肌的MG29蛋白表達(dá)水平采用蛋白免疫印跡法(Western Blot)測試,各樣本的測試結(jié)果如下。

圖6 用蛋白免疫印跡法測試MG29蛋白表達(dá)水平電泳圖Figure 6 Results of Western Blot

使用Image J軟件將各樣本的上述灰度實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)字化,再用靶蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值,即可得到各樣本MG29蛋白的相對含量。

圖7 各樣本MG29(A-14)/β-actin柱狀分析圖Figure 7 Histograms of MG29(A-14)/β-actin

用SPSS 17.0經(jīng)單因素方差分析進(jìn)行差異檢驗(yàn),結(jié)果顯示:L G組和MG組相比,其MG29蛋白水平無明顯差異;CG和HG組的MG29蛋白水平亦無顯著性差異;但LG組和MG組均顯著高于CG組和HG組(P<0.01,表6)。

表6 本研究股直肌MG29蛋白的相對含量一覽表(±SD)Table 6 Relative Expressions of MG29

表6 本研究股直肌MG29蛋白的相對含量一覽表(±SD)Table 6 Relative Expressions of MG29

注:＊＊與CG組相比P<0.01;##與HG組相比P<0.01。＊＊P<0.01,Compared with the CG,##P<0.01,Compared with the HG.

CGL GMGHG MG29 1.07±0.21＊＊##1.41±0.27＊＊##1.35±0.260.95±0.29

3 小結(jié)與討論

3.1 有關(guān)運(yùn)動負(fù)荷的討論

諸多研究已經(jīng)證實(shí)了間歇運(yùn)動對心肌的保護(hù)作用[7,10],以及對骨骼肌的能量供應(yīng)的積極作用[12],考慮到老齡鼠心血管系統(tǒng)等的功能衰退,因此,本實(shí)驗(yàn)采用了跑2 min,休息2 min的間歇運(yùn)動的訓(xùn)練方式。此外,跑臺速度的設(shè)置和以及訓(xùn)練組數(shù)、次數(shù)的設(shè)置均通過預(yù)實(shí)驗(yàn),以安全有效為原則。運(yùn)動組大鼠的運(yùn)動負(fù)荷除負(fù)重外均相同,因此,本實(shí)驗(yàn)中的30%、50%和60%最大負(fù)重的分組,可間接反映負(fù)荷強(qiáng)度的大小。

3.2 有關(guān)間歇負(fù)重跑訓(xùn)練改善老齡大鼠一般狀態(tài)的討論

運(yùn)動組大鼠飲食積極、樂于活動、精神矍鑠、毛色較鮮亮且有光澤,L G組大鼠的表現(xiàn)尤為突出。生理性衰老是正常生物體發(fā)育成熟后,隨著年齡增加而發(fā)生的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等各系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生退行性變化的自然進(jìn)程,是諸多因素作用的綜合結(jié)果。本研究中的老齡鼠均出現(xiàn)了毛色枯黃、脫毛、行動遲緩等現(xiàn)象,正是老齡鼠各系統(tǒng)功能退化的所致。與CG組相比,運(yùn)動組飲食積極、樂于活動、精神矍鑠、毛色鮮亮而有光澤,脫毛量較少,這說明間歇負(fù)重跑運(yùn)動干預(yù)了自然衰老進(jìn)程,使神經(jīng)肌肉等系統(tǒng)的功能趨向于積極化[8]。而L G組大鼠的表現(xiàn)更為積極則暗示著這種負(fù)荷對于這些老齡鼠的各器官來說可能是一個比較適宜的運(yùn)動刺激。

運(yùn)動組大鼠的體重先降后升,后又下降。自然衰老過程中,機(jī)體的體重呈現(xiàn)不同程度的增長,這可能是增齡的脂代謝紊亂,體內(nèi)脂肪和結(jié)締組織蓄積所致[34],本實(shí)驗(yàn)中CG組的體重增長線圖證實(shí)了此觀點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中,8周的不同負(fù)荷間歇跑運(yùn)動干預(yù)了上述線圖,使之呈現(xiàn)先降低、后升高,而后又下降的曲線。運(yùn)動訓(xùn)練開始后的1～2周,體重曲線是下降的,分析原因可能是運(yùn)動鼠對運(yùn)動訓(xùn)練不適應(yīng),其飲食等生活規(guī)律受到影響所致,此外,汗液等體內(nèi)水分的排出也可能是另一因素;在運(yùn)動后的3～4周,運(yùn)動組的體重曲線呈現(xiàn)升高趨勢,這可能是運(yùn)動鼠適應(yīng)了運(yùn)動訓(xùn)練,飲食、飲水量增加所致;大約在運(yùn)動4周后,體重曲線又開始下降,這可能是該運(yùn)動刺激影響了體內(nèi)的脂類代謝,機(jī)體的脂肪和結(jié)締組織減少所致[3]。但體重數(shù)據(jù)是一個宏觀指標(biāo),影響因素較多,需要結(jié)合其他指標(biāo)來說明問題。

3.3 間歇負(fù)重跑訓(xùn)練與骨骼肌的形態(tài)學(xué)特征

在正常衰老進(jìn)程中,機(jī)體細(xì)胞需要對抗各種各樣的外界刺激,如自由基或病原菌入侵、損傷、運(yùn)動等。細(xì)胞膜作為一道堅(jiān)固的防御屏障,戰(zhàn)斗在最前沿,它最先感受到刺激,并做出反應(yīng)。本研究中發(fā)現(xiàn)的大量的圓形肌纖維可能就是細(xì)胞膜對刺激做出反應(yīng)的結(jié)果[6],自然衰老的安靜組大鼠的肌纖維圓形化程度最為嚴(yán)重,這使相鄰肌纖維間間隙增大,光鏡下發(fā)現(xiàn)的增大細(xì)胞間隙中的白色組織可能是老齡骨骼肌增多的脂肪組織或(和)結(jié)締組織在其中填充[22],這大大影響了骨骼肌的正常功能,進(jìn)一步影響了骨骼肌的內(nèi)部形態(tài),使本來位于細(xì)胞膜下的細(xì)胞核向細(xì)胞中央移動,類似于未成熟肌細(xì)胞的形態(tài)。部分小肌群的肌細(xì)胞因功能受到嚴(yán)重影響,胞質(zhì)減少而萎縮,呈角化的肌纖維,甚而整個小肌群萎縮,由脂肪和結(jié)締組織替代[15,18]。

與安靜對照組相比,L G和MG組大鼠的肌組織圓形化程度低,肌細(xì)胞排列較整齊,較緊密,細(xì)胞間隙的脂肪滴、結(jié)締組織大大減少,這可能是30%最大負(fù)重和50%最大負(fù)重的間歇負(fù)重跑這兩種運(yùn)動刺激使大部分肌纖維繼續(xù)保持運(yùn)動功能而又不產(chǎn)生過度損傷[17],從而延緩了肌細(xì)胞的正常衰老進(jìn)程,減少了脂滴和結(jié)締組織在肌纖維間的替代和蓄積;而HG組的肌纖維圓形化程度高,脂肪和結(jié)締組織多可能是由于強(qiáng)度過大的運(yùn)動對細(xì)胞產(chǎn)生了損傷。此外,在MG和HG組的切片中還發(fā)現(xiàn)了部分比L G組和CG組的直徑粗很多的肌纖維,這說明可能該強(qiáng)度運(yùn)動能夠刺激某些肌纖維使其加粗[21]。

3.4 間歇負(fù)重跑訓(xùn)練與老齡大鼠的勻漿脂褐質(zhì)指標(biāo)

機(jī)體組織在自然衰老過程中需要不斷對抗各種自由基的攻擊,脂褐質(zhì)就是體內(nèi)不飽和脂質(zhì)在對抗自由基的攻擊時產(chǎn)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物[37],因體內(nèi)任何細(xì)胞、細(xì)胞器或其他超微結(jié)構(gòu)都離不開由大量不飽和脂肪酸構(gòu)成的胞質(zhì)膜,所以,脂褐質(zhì)被作為反映組織衰老的重要標(biāo)志物[37]。在自然衰老過程中,骨骼肌組織不斷對抗自由基的攻擊,使脂褐質(zhì)在胞漿內(nèi)逐漸增多[37],本實(shí)驗(yàn)采用熒光比色法在安靜大鼠的肌組織中檢測出的大量脂褐質(zhì)證實(shí)了這點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示,L G和MG組的股直肌的平均脂褐質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于其他2組,這可能是由于和其他2組相比,該強(qiáng)度下的間歇負(fù)重跑運(yùn)動能夠更加有效地減少骨骼肌內(nèi)自由基的生成,或者能夠更有效地促進(jìn)自由基的清除,從而使自由基在肌組織內(nèi)的蓄積減少,減少了自由基對胞質(zhì)膜的攻擊[20],延緩了骨骼肌的衰老進(jìn)程。

盡管運(yùn)動時的氧耗增加,自由基產(chǎn)生的速率也隨之升高[20],但由于耐力訓(xùn)練促使骨骼肌線粒體的數(shù)目增多且功能增強(qiáng)[35],因而,在適宜強(qiáng)度的耐力訓(xùn)練情況下,相對氧耗是降低的,產(chǎn)生自由基的相對速率是降低的[35]。但是如果運(yùn)動干預(yù)的強(qiáng)度不適宜,就會使體內(nèi)自由基蓄積顯著增加[17],甚至?xí)^自然衰老狀態(tài)。在本研究中,HG組的平均脂褐質(zhì)含量顯著高于CG組,這可能是該強(qiáng)度下的運(yùn)動不能有效地刺激骨骼肌線粒體的數(shù)目增多或增多不明顯,從而使骨骼肌組織內(nèi)自由基的生成速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于清除速率,造成自由基在肌組織內(nèi)大量蓄積,大量胞質(zhì)膜受到攻擊所致,因而,該強(qiáng)度下運(yùn)動實(shí)際上加速了骨骼肌的衰老進(jìn)程。而50%最大負(fù)重運(yùn)動組的平均脂褐質(zhì)含量與安靜對照組相比無顯著差異,這可能是該強(qiáng)度下運(yùn)動產(chǎn)生的自由基量和清除的自由基量大致相等,從而相互抵消,因而對骨骼肌的自然衰老進(jìn)程未產(chǎn)生明顯影響。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,30%和50%最大負(fù)重的間歇負(fù)重跑運(yùn)動可以有效降低肌組織中的脂褐質(zhì)含量,而60%最大負(fù)重的間歇負(fù)重跑運(yùn)動可能是一種超負(fù)荷,對自由基的代謝產(chǎn)生了負(fù)面影響。

3.5 間歇負(fù)重跑訓(xùn)練與老齡大鼠的勻漿鈣水平

鈣是骨骼肌收縮和舒張的重要耦聯(lián)因子,肌肉收縮時動員鈣的速率直接決定了肌肉的收縮功能[14]。生理情況下,細(xì)胞外液的Ca2+濃度約是細(xì)胞內(nèi)的10 000倍[9],因此,微量的胞外鈣流入即對骨骼肌纖維產(chǎn)生巨大的影響。老齡鼠因肌肉本身結(jié)構(gòu)的變化造成肌漿網(wǎng)鈣庫耗空[27],從而更加依賴胞外鈣[31],如不能有效地動員外部鈣,其肌肉功能會進(jìn)一步衰退。

本實(shí)驗(yàn)采用甲基百里香酚藍(lán)比色法測定的股直肌肌腹勻漿肌組織的鈣量,是肌細(xì)胞內(nèi)外鈣量的總和,可直接反映老齡大鼠機(jī)體對該骨骼肌所分配的鈣量,亦可能間接反映調(diào)運(yùn)鈣入肌細(xì)胞內(nèi)的程度。4組對比,運(yùn)動各組的鈣含量顯著高于CG組,這可能是因運(yùn)動需要機(jī)體為骨骼肌分配了較多的鈣量[28],同時,也可能反映了運(yùn)動組各鼠因運(yùn)動需要而動員了更多的外部鈣[36]。將各運(yùn)動組進(jìn)行對比,可發(fā)現(xiàn)L G組的鈣含量又明顯高于其他2組,這可能說明該強(qiáng)度下的負(fù)重跑運(yùn)動是比較適宜的運(yùn)動刺激,可能能夠刺激機(jī)體給骨骼肌分配較多的鈣量,同時動員更多的外部鈣流入肌細(xì)胞,使肌肉保持較好的運(yùn)動功能。MG和HG組的鈣含量對比不具有顯著性差異,其一,可能是此兩種強(qiáng)度下運(yùn)動調(diào)運(yùn)鈣的能力無差異,其二,亦可能存在肌內(nèi)膜因高強(qiáng)度的運(yùn)動而產(chǎn)生損傷[17],胞外鈣涌入細(xì)胞內(nèi),雖然鈣濃度升高,但收縮功能卻受到損傷,具體原因尚須結(jié)合其他指標(biāo)綜合分析。

肌肉收縮后,胞漿內(nèi)的鈣還要被快速有效地回收,這樣才能保持正常的收縮舒張功能,否則,胞漿長時蓄積高濃度的鈣會觸發(fā)細(xì)胞凋亡機(jī)制,加速肌細(xì)胞萎縮、凋亡[31]。因此,本研究中測試的鈣指標(biāo)還要結(jié)合其他指標(biāo)進(jìn)行綜合分析。

3.6 間歇負(fù)重跑訓(xùn)練與老齡大鼠的MG29蛋白表達(dá)

MG29蛋白是調(diào)控胞外鈣流入的重要蛋白,它通過打開骨骼肌橫管膜上的SOCE通道,而促進(jìn)外部鈣流入胞漿[24]。此外,MG29蛋白對維持骨骼肌的正常的三聯(lián)管結(jié)構(gòu)也起著非常重要的作用[19]。本研究采用Western Blot法測試骨骼肌內(nèi)的MG29蛋白水平,結(jié)果顯示,L G和MG組的MG29蛋白水平顯著高于其他2組,也許是此2種強(qiáng)度的運(yùn)動刺激是比較適宜的運(yùn)動刺激,它們直接或間接導(dǎo)致了骨骼肌內(nèi)MG29蛋白水平升高。然而,本研究也發(fā)現(xiàn), L G組的MG29蛋白表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CG組,筆者推測這可能是該強(qiáng)度下運(yùn)動負(fù)向影響了骨骼肌的收縮機(jī)制,直接或間接導(dǎo)致了MG29蛋白減少。

3.7 不同負(fù)荷間隙負(fù)重跑訓(xùn)練對老齡大鼠骨骼肌MG29蛋白影響的綜合思考

綜上所述,適宜強(qiáng)度的間歇負(fù)重跑訓(xùn)練能夠有效提高老齡大鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的MG29蛋白水平,有效地改善骨骼肌細(xì)胞的形態(tài)和功能,從而可能在一定程度上延緩因增齡所致的肌肉萎縮、丟失,延緩Sarcopenia進(jìn)程。

30%最大負(fù)荷的間歇負(fù)重跑運(yùn)動對于老齡骨骼肌來說是比較適宜的運(yùn)動刺激,它通過力的機(jī)械刺激,提高骨骼肌橫管膜上的MG29蛋白的表達(dá)水平,從而維持骨骼肌正常的三聯(lián)管膜結(jié)構(gòu)[19],減緩了其因衰老所致的退行性變化,保證了正常的收縮機(jī)制;同時,增多的MG29蛋白也能夠促進(jìn)較多的胞外鈣流入胞漿[24],改善衰老骨骼肌胞漿內(nèi)的收縮鈣匱乏的現(xiàn)象,此外,該強(qiáng)度下運(yùn)動還刺激機(jī)體為骨骼肌分配較多的鈣量,從而可能使骨骼肌的興奮收縮耦聯(lián)功能得到保持或增強(qiáng)。這種正常的收縮結(jié)構(gòu)的維持和正常的收縮功能的保持使骨骼肌處于良性循環(huán)狀態(tài),從而可能減緩正常衰老進(jìn)程中因肌肉失能導(dǎo)致的肌肉萎縮,肌肉丟失以及結(jié)締組織和脂肪組織的替代,相對降低了體內(nèi)的自由基水平。因而,30%最大負(fù)荷的間歇負(fù)重跑運(yùn)動組的衰老指征不明顯,肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)上顯示,各肌纖維間排列較整齊而緊密,脂褐質(zhì)的蓄積也遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于其他組,大鼠精神矍鑠,飲食積極,活動積極,毛色有光澤,脫毛也較少。

50%最大負(fù)荷負(fù)重跑運(yùn)動也能夠有效地改善MG29蛋白的表達(dá)水平,維持三聯(lián)管膜的正常結(jié)構(gòu),使胞外鈣流入增加,同時,該強(qiáng)度的運(yùn)動刺激亦能使機(jī)體為骨骼肌分配較多的鈣量,從而保持肌肉正常的收縮功能,因而,該組的鈣水平也較高,減緩了正常衰老過程中的肌肉萎縮、丟失及結(jié)締組織和脂肪組織替代。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),該強(qiáng)度下運(yùn)動刺激還可能使部分肌纖維的橫徑增加。

60%最大負(fù)荷間歇負(fù)重跑運(yùn)動對于老齡鼠來說可能不是一個適宜的運(yùn)動刺激,該強(qiáng)度下運(yùn)動可能導(dǎo)致自由基水平在骨骼肌內(nèi)顯著升高,因而,脂褐質(zhì)蓄積顯著高于其他3組。這種過大強(qiáng)度的運(yùn)動刺激雖然也可能使有機(jī)體為骨骼肌分配較多的鈣量,但同時可能導(dǎo)致了肌細(xì)胞膜的破壞,鈣從胞外涌入,因而鈣水平較高,MG29蛋白水平卻較低。在光鏡下觀察該組的骨骼肌圓形化嚴(yán)重,出現(xiàn)角化肌纖維和過多的脂肪和結(jié)締組織等可能就是部分肌纖維萎縮、丟失的表現(xiàn)。此外,該強(qiáng)度運(yùn)動也使部分肌纖維橫徑增加,可能是體內(nèi)代償機(jī)制發(fā)揮作用,也可能有其他因素。總之,本實(shí)驗(yàn)中,60%最大負(fù)荷的間歇負(fù)重跑運(yùn)動不能有效地提高骨骼肌MG29蛋白水平,其確切機(jī)理尚期待后續(xù)研究。

4 總結(jié)

1.較小或中等強(qiáng)度的間歇負(fù)重跑運(yùn)動對于老齡大鼠來說,可能是比較適宜的運(yùn)動刺激,它能夠有效地提高骨骼肌內(nèi)的MG29蛋白的表達(dá)水平,從而使骨骼肌維持正常的興奮收縮偶聯(lián)結(jié)構(gòu),并促進(jìn)胞外鈣流入,同時,促進(jìn)有機(jī)體為骨骼肌分配較多的鈣量,可能有助于保持或增強(qiáng)骨骼肌的正常收縮功能,相對降低細(xì)胞內(nèi)的自由基水平,從而延緩了因衰老所致肌肉萎縮、丟失。

2.較大強(qiáng)度的間歇負(fù)重跑運(yùn)動對于老齡大鼠來說可能是不適宜的運(yùn)動刺激,因該強(qiáng)度下運(yùn)動反而使MG29蛋白減少,使骨骼肌的收縮功能減弱,且骨骼肌內(nèi)自由基水平顯著升高,脂褐質(zhì)大量蓄積,該強(qiáng)度下運(yùn)動可能加速骨骼肌衰老進(jìn)程。

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Effects of Different Load-bearing Interval Running on Protein MG29 in Aged Skeletal Muscles of Rats

LI Wen-hui,ZHAO Bin,YAN Wan-jun

Objective:To investigate the correlation between different load-bearing interval running and MG29 level in aged body of rats.Methods:32 Wistar rats aged at 17-months were chosen as the subjects of this experiment.They were grouped into 4 randomly.Of the 4 groups,one was control group(CG)and the other 3 were exercise training groups(EG), which were respectively low load group(L G),medium load group(MG)and high load group (HG)and were respectively burdened with 30%、50%and 60%the weights of their maximum loads.For the exercise training groups they were exerted interval run training on treadmill with the above burdens separately for 8 weeks.One set of training consisted of running 2 minutes and resting 2 minutes and 6 sets of this continuous training were exerted,one time for every day and 6 times for every week with Sunday resting.All the rats were weighed one time a week,their hair color and mental status were observed every day.At the end of the eighth training week and after the last training,the left mid-rectus femoris muscles of the subjects were cut up.Routine frozen sections were made with HE staining and afterwards an optical microscope was used to watch the histologic morphology determinations.After homogenation,in muscles the content of lipofuscin was assayed by fluorimetry colorimetry,the concentration of calcium was assayed by methylthymol blue colorimetry and MG29 level was assessed by western blot analysis.Conclusions:1)Low and medium intensity of interval load-bearing running may be a proper motor stimulation for delaying the aging process of skeletal muscles in rats.It can elevate the MG29 level in skeletal muscles effectively,consequently keep the normal structures of excitation contraction coupling,thus promote extracellular calcium entry,and hold even boost up the functions of skeletal muscles.As a result,the free radicals in fibers reduce relatively,muscular atrophy and lost decreases,and it happens that the process of sarcopenia delays.2)Maybe high intensity of interval load-bearing running is not a proper motor stimulation for aging skeletal muscle in rats,under this motor stimulation,the MG29 level falls significantly,thus the functions of skeletal muscles shrink greatly,and the free radical level rise apparently,the cumulation of lipofusion grows largely.

aging;Sarcopenia;calcium homeostasis;MG29;load-bearing running;rat

G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

1000-677X(2010)09-0073-09

2010-07-23;

2010-08-25

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C2008000177)。

李文惠(1973-),女,河北南宮人,在讀碩士研究生,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動保健、運(yùn)動延緩骨骼肌衰老、運(yùn)動傷病防治理論與實(shí)踐,E-mail:liwenhui3061563@163.com;趙斌(1956-),男,河北張家口人,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動保健學(xué)、運(yùn)動傷病防治的理論與實(shí)踐、運(yùn)動延緩骨骼肌衰老;閆萬軍(1965-),男,山西祁縣人,研究員,博士,碩士研究生導(dǎo)師,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動促進(jìn)健康的理論與應(yīng)用。

河北師范大學(xué)體育學(xué)院,河北石家莊050016 Hebei Normal University,Shijiazhuang 050016,China.