王海雁，王曉麗，劉 宏，馮 峰

(山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山西大同 037009）

熒光法分析丙烯酰胺對人外周血淋巴細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的影響

王海雁，王曉麗，劉 宏，馮 峰

(山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山西大同 037009）

應(yīng)用fura-2-AM熒光探針，研究不同劑量丙烯酰胺對淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)定狀態(tài)的影響，并探討其作用機制.

丙烯酰胺 fura-2-AM 淋巴細(xì)胞 胞內(nèi)鈣離子濃度

丙烯酰胺(AA)可以引起人體神經(jīng)，主要是周圍神經(jīng)的損害.國際癌癥研究機構(gòu)將丙烯酰胺列為2A組“可能人類致癌物”，歐盟認(rèn)為其對人體存在潛在危險性[1]；但目前的人群流行病學(xué)調(diào)查資料尚未明確丙烯酰胺與癌癥之間的相關(guān)性.Baum等認(rèn)為420μg/mL的丙烯酰胺對V79細(xì)胞和人血淋巴細(xì)胞無明顯的基因毒性，21～210μg/mL的環(huán)氧丙酰胺卻能產(chǎn)生DNA損傷[2].Blasiak等證實0.035～3.5μg/mL丙烯酰胺對人外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生潛在的基因毒性，3.5μg/mL丙烯酰胺誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂，若細(xì)胞的自我修復(fù)過程中繼續(xù)存在丙烯酰胺，則其導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞DNA損傷無法完全修復(fù)[3].鈣離子作為偶聯(lián)胞外刺激和胞內(nèi)反應(yīng)的第二信使，參與淋巴細(xì)胞許多重要功能的調(diào)解[4].本研究應(yīng)用fura-2-AM熒光探針，探討究不同劑量丙烯酰胺對淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)定狀態(tài)的影響，并探討其作用機制.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

Fura-2-AM(acetoxymethyl ester form of fura-2)、烏本苷(ouabain)、尼卡地平(nicardipine)和 N-2-羥乙基呱嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES，Sigma USA)；芋螺毒素 (ω-conotoxin，Alexis Biochemicals，Germany)；淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠)；細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640(Gibco BRL)；丙烯酰胺(AA)(＞99%) (Aldrich Milwaukee，WI，USA).VARIAN Cary-eclipse熒光磷光發(fā)光分光光度計(Varian USA)；BC-3000全細(xì)胞血液細(xì)胞分析儀 (深圳 Mindray Biomedical electronics CO.LTD)

1.2 實驗過程

細(xì)胞生化應(yīng)用軟件 (Intracelluar Bio-chemistry Application)采集處理數(shù)據(jù)，雙波長檢測法(Ratio Data Collection)37℃條件下測試.激發(fā)波長分別為340 nm和380 nm，發(fā)射波長固定在510 nm，狹縫寬均為10 nm.儀器軟件可根據(jù)公式 [Ca2+]i＝Kd×[(RRmin)/(Rmax-R)]×(Sf2/Sb2)直接得出胞漿內(nèi)游離鈣離子的濃度[5].其中Kd值在本實驗條件下校正為187 nmol/L.文中數(shù)據(jù)為±s(n＝3～5)，統(tǒng)計學(xué)分析采用t-test，P＝0.05為檢驗水準(zhǔn).

2 結(jié)果與討論

2.1 丙烯酰胺與Fura-2-Ca的作用

丙烯酰胺為小分子親電子物質(zhì)，能夠穿透細(xì)胞膜，細(xì)胞膜上或胞內(nèi)細(xì)胞器含有硫醇的蛋白質(zhì)有可能成為其結(jié)合的靶位點[4].模擬細(xì)胞內(nèi)生理液中丙烯酰胺和fura-2-Ca的作用見圖1，可知模擬細(xì)胞內(nèi)生理液中加入的丙烯酰胺對fura-2-Ca螯合物的熒光強度無影響.即在丙烯酰胺的作用下，若淋巴細(xì)胞內(nèi)fura-2-Ca螯合物的熒光強度表達(dá)的胞內(nèi)游離鈣離子濃度 [Ca2+]i發(fā)生變化，是因為丙烯酰胺和淋巴細(xì)胞內(nèi)某些蛋白相互結(jié)合作用的結(jié)果.

2.2 不同劑量丙烯酰胺對胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)定狀態(tài)的影響

以淋巴細(xì)胞靜息狀態(tài)下的 [Ca]i100 nmol/L為對照，由圖2a可見，終濃度低于70μg/mL劑量的丙烯酰胺使[Ca2+]i明顯高于靜息狀態(tài)，△[Ca2+]i為正值；而高劑量的丙烯酰胺(＞70μg/mL)使[Ca2+]i呈劑量依賴性下降，△[Ca2+]i均為負(fù)值.150 s加入丙烯酰胺后(圖2b)，低濃度(36μg/mL)的丙烯酰胺輕微刺激細(xì)胞，令胞內(nèi)鈣水平瞬間增加，100 s之內(nèi)胞內(nèi)游離鈣離子達(dá)到一較高濃度平臺，比作為對照的靜息狀態(tài)的細(xì)胞鈣水平高出約25 nmol/L.低劑量丙烯酰胺明顯升高胞內(nèi)鈣水平，是其激活外鈣內(nèi)流通道、抑制膜上鈣泵、干擾細(xì)胞膜上能量調(diào)節(jié)機制，引起細(xì)胞鈣調(diào)節(jié)機制變化的原因[5].濃度為70μg/mL時，測試時間之內(nèi)胞內(nèi)鈣離子濃度會迅速降低10 nmol/L左右，并在之后400 s內(nèi)緩慢恢復(fù)至原來鈣水平；更高濃度的丙烯酰胺會刺激淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣水平繼續(xù)降低，在測試時間段胞內(nèi)鈣水平不會恢復(fù)，而且劑量越大，內(nèi)鈣流失越多，鈣濃度均較對照顯著降低(P＜0.01).高濃度丙烯酰胺作用下，丙烯酰胺小分子與胞內(nèi)功能型蛋白結(jié)合，通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜上的鈣泵表達(dá)，誘導(dǎo)胞內(nèi)游離鈣外流，從而降低淋巴細(xì)胞內(nèi)的鈣超載，說明高濃度的丙烯酰胺能夠阻礙外鈣信號逆濃度梯度的跨膜傳達(dá).揭示丙烯酰胺對人外周血淋巴細(xì)胞存在在低劑量的免疫興奮效應(yīng)和高劑量的免疫抑制效應(yīng).

圖1 0～7 000μg/m L的丙烯酰胺對fura-2-Ca螯合物的熒光強度無影響

圖2 丙烯酰胺對淋巴細(xì)胞胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的干擾

2.3 丙烯酰胺作用時間對胞內(nèi)鈣水平的影響

30 min之內(nèi)隨著孵育時間延長，丙烯酰胺濃度增大，其促進內(nèi)鈣外流的能力加強，存在明顯的量效關(guān)系(圖3).120 min后較低劑量丙烯酰胺(＜560μg/mL)作用下的淋巴細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度，接近靜息狀態(tài)鈣水平，說明淋巴細(xì)胞有一定能力恢復(fù)較低劑量丙烯酰胺對胞內(nèi)鈣水平的擾動.

2.4 鈣離子通道抑制劑對丙烯酰胺升鈣作用的影響

鈣通道非特異性抑制劑LaCl3、電壓依賴L型鈣通道抑制劑 nicardipine以及具有鎮(zhèn)痛活性的電壓依賴N型鈣通道抑制劑ω-conotoxin中，只有ωconotoxin能夠顯著降低低劑量丙烯酰胺引發(fā)的內(nèi)鈣升高(表1).揭示丙烯酰胺針對不同類型離子通道作用靶點不同.

2.5 胞外鈣、鈉、鉀離子濃度對丙烯酰胺作用的影響

分別改變胞外鈣、鈉、鉀離子的濃度對丙烯酰胺作用的影響見表1.雖然丙烯酰胺導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞胞內(nèi)鈣超載與鈣缺乏相互對立，但胞外1 mmol/L鈣離子比無鈣介質(zhì)明顯加強了丙烯酰胺的作用；25 mmol/L的高鉀環(huán)境也能夠增強丙烯酰胺的影響.強心劑烏本苷(ouabain)能抑制細(xì)胞Na+-K+泵的活性，烏本苷孵育細(xì)胞并在無鈉介質(zhì)中測試，可以開啟反向鈉鈣交換通道，促進外鈣內(nèi)流[6]，丙烯酰胺的加入抵消了烏本苷的作用.說明丙烯酰胺對淋巴細(xì)胞

[Ca]i的干擾與細(xì)胞內(nèi)含量豐富的K、Na和Ca的協(xié)同作用相關(guān)聯(lián).

表1 不同緩沖體系中各種藥物對淋巴細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的作用／nmol/L

圖3 與對照(▼)相比較淋巴細(xì)胞對不同濃度丙烯酰胺作用的回復(fù)能力測試

2.6 抗氧化劑對丙烯酰胺作用的影響

淋巴細(xì)胞基因毒性的研究中證實抗氧化劑維生素E有助于修復(fù)丙烯酰胺引發(fā)的DNA損傷，抗氧化作用被認(rèn)為是其潛在的抗癌的生物學(xué)效應(yīng)中一個重要的機制.而食用富含維生素C的柑橘類水果可以有效降低丙烯酰胺在人尿中代謝物的排放.由表1可知維生素C和維生素E非常顯著抑制了丙烯酰胺的干擾作用，說明日常飲食中的抗氧化劑有望修復(fù)丙烯酰胺造成的胞內(nèi)鈣水平異常.

3 結(jié)論

本試驗表明丙烯酰胺對胞內(nèi)鈣離子濃度變化的擾動表現(xiàn)為低濃度增加高濃度抑制，該雙相干擾可以被25μmol/L維生素C、維生素E顯著抑制.雖然鈣超載與鈣缺乏相互對立，但均由同一刺激引起.該作用與細(xì)胞內(nèi)鈉離子和鉀離子協(xié)同相關(guān)，最終導(dǎo)致胞內(nèi)鈣水平低于正常.淋巴細(xì)胞有一定能力恢復(fù)較低劑量丙烯酰胺(＜560μg/mL)對胞內(nèi)鈣水平的擾動.

[1]FAO/WHO Consultations on the Health Implications of Acrylamide in Food[EB/OL].(2002-06-25)[2007-07-12].Reportof a Joint FAO/WHO Consultation，Geneva，Switzerland.

[2]Bauma M，F(xiàn)authb E，F(xiàn)ritzena S，et al.Acrylamide and Glycidamide：Genotoxic Effects in V79-cells and Human Blood[J].Mutat Res，2005，580：61-69.

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[6]Wei Chunying，Yang Pin，Wang Haiyan.Quantitative Study on La3+Influx Mediated by Sodium-Calcium Exchanger in Human Lymphocytes[J].JScience in China，2002，32(4)：367-376.

A Study on the Effect of Acrylam ide on Intracellular Ca2+in Human Peripheral Lym phocytes by Fluorometric Method

WANG Hai-yan，WANG Xiao－li，LIU Hong，F(xiàn)ENG feng
(School of Chemistry and Chemical Engineering，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009)

The effect of acrylamide on intracellular free calcium concentration was studied by monitoring the fluorescence of human peripheral lymphocytes loaded with fura-2.

Acrylamide；Fura-2-AM；Lymphocytes；Ca2+signaling

O657.3

A

〔編輯 楊德兵〕

1674-0874(2010)01-0044-04

2009-10-13

山西省自然科學(xué)基金項目[2009011015-1]；山西大同大學(xué)?？蒲许椖縖2008K3]

王海雁(1972-)，女，山西大同人，博士，副教授，研究方向：光譜分析.