朱培坤 ，李朝陽 ，李 菁 ，李 鸝

（1.深圳市百綠生物染色體雜交研究所，廣東 深圳 518172；2.吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點實驗室，湖南 吉首 416000）

野生近緣雜交是優(yōu)良農(nóng)藝性狀獲得的重要途徑之一，通過種間雜交及后代選育，可得品質(zhì)優(yōu)良的作物新品種。遠(yuǎn)緣雜交是屬以上的種間雜交，容易存在雜交不親和及后代不育等現(xiàn)象，給新品種育種帶來困難。近期在植物屬間遠(yuǎn)緣雜交方面取得了很大的進(jìn)展，目前已在多個屬間如小麥屬與黑麥屬[1]、偃麥草屬[2]、草莓屬[3]，動物如雞與鵪鶉等[4]的屬間遠(yuǎn)緣雜交取得了成功。遠(yuǎn)緣雜交的成功給農(nóng)作物雜種生產(chǎn)，改良農(nóng)作物品質(zhì)帶來了曙光。

豌豆屬蝶形花科豌豆屬植物，玉米屬禾本科玉米屬植物，二者分屬雙子葉植物綱和單子葉植物綱。近期有學(xué)者嘗試將豌豆與玉米進(jìn)行了遠(yuǎn)緣雜交，并獲得了可育的后代[5]。研究其雜種后代的遺傳基礎(chǔ)，對評價其雜種后代真實性以及進(jìn)一步研究利用有重要意義。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism,SRAP）是一種新的DNA分子標(biāo)記，具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率和容易得到選擇條帶序列等特點，廣泛應(yīng)用于圖譜構(gòu)建、性狀的標(biāo)記、遺傳多樣性分析以及雜交后代真實性的鑒定[6]。本實驗對豌豆和玉米雜交后代進(jìn)行SRAP分析，檢測其雜交后代的真實性，以期為該雜交后代的合理開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供體豌豆（Py）、受體玉米（MF、M540）、雜交后代（Py-MF和Py-M540）種子都由深圳百綠生物科技有限公司提供[5]。試驗于2008年4月將5個供試種進(jìn)行播種，生長期記錄生長狀況，7月采集各植株葉片進(jìn)行相關(guān)試驗。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取5個類型植株的葉片混合，改良CTAB法提總DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及檢測 從42對SRAP引物中篩選出10對引物進(jìn)行擴(kuò)增（引物序列見表1）。擴(kuò)增程序為：94℃ 預(yù)變性 5 min；94℃ 變性 1 min，35℃復(fù)性1 min,72℃延伸1 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min，50℃復(fù)性 1 min，72℃延伸 1 min，35 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。用1%的瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳結(jié)束后在英國UVP公司的GDS 7500凝膠成像系統(tǒng)中成像，拍攝并保存結(jié)果。

表1 試驗所用SRAP引物

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 將電泳得到的擴(kuò)增圖譜的每一條帶都代表引物的結(jié)合位點。有擴(kuò)增條帶記為1，無帶記為0，強帶和弱帶的賦值都為1。對于多態(tài)位點，將在重復(fù)試驗中能穩(wěn)定出現(xiàn)的差異帶用于數(shù)據(jù)分析。利用GenePOP軟件對RAPD分析所得到的表型矩陣進(jìn)行遺傳參數(shù)分析。僅計算Nei′s遺傳距離（D），并根據(jù) Nei′s遺傳距離，利用 GenePOP 軟件的UPGMA法分析居群間的遺傳關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米生長期形態(tài)差異觀察

如圖1所示，從幼苗開始，Py-M540的莖尖嚴(yán)重右向卷曲，導(dǎo)致莖尖橫向生長，故植株矮小且節(jié)間短，莖稈瘦弱，株高僅為受體M540的一半，但成熟葉片與受體M540的葉形無差別，M540的莖尖也有輕微卷曲，但仍然向上生長。而同一供體的另一雜交后代Py-MF則表現(xiàn)出與Py-M540完全不同的形態(tài)特征：長勢強壯，葉片短而寬大，葉片基部夾角非常小，幾乎與莖稈平行的成簇上伸，并不卷曲，節(jié)間非常短，其受體MF的莖尖也不卷曲，葉片長而寬，節(jié)間長。

圖1 受體玉米及其雜交后代的生長期形態(tài)特征

2.2 10對引物對豌豆和玉米及其雜交后代的擴(kuò)增結(jié)果

對42對SRAP引物進(jìn)行篩選擴(kuò)增，最終選擇了擴(kuò)增條帶清晰，多態(tài)性強的10對引物對Py、MF、M540、Py-MF和Py-M540進(jìn)行了擴(kuò)增，共獲得105條重復(fù)性高的清晰條帶，其中有101條為多態(tài)，多態(tài)比率（PPB）為96.19%。

2.3 供體和受體基因在2個雜交后代中的表達(dá)

10 對引物中，me1-em9、me1-em3、me1-em4、me2-em1和me4-em8 5對引物在Py-M540和Py-MF中擴(kuò)增出雙親特異帶（圖2）。在Py-MF和Py-M540中出現(xiàn)了Py的特征帶（圖中箭頭所指），表明2個后代具有雙親的遺傳物質(zhì)，豌豆的遺傳物質(zhì)進(jìn)入了玉米基因組，此結(jié)果從DNA分子水平上初步證實了Py-M540和Py-MF可能是豌豆和玉米雜交的真實后代。

圖2 豌豆和玉米雜交后代的SRAP驗證

2.4 SRAP標(biāo)記的聚類分析

根據(jù)SRAP引物擴(kuò)增結(jié)果，對5個樣本進(jìn)行了遺傳距離計算和聚類分析（表2，圖3）。觀察等位基因數(shù)na=1.961 9，有效等位基因數(shù)ne=1.629 3，Nei基因多樣性指數(shù)h為0.370 3。從遺傳距離比較來看，Py-MF與Py-M540的距離最近，與其親本MF的距離次之，與供體Py的距離最遠(yuǎn)。同樣，Py-M540與其親本M540的關(guān)系次于它與Py-MF的關(guān)系距離。以Nei的遺傳距離為基礎(chǔ)作聚類圖，大致可分為3個聚類群，其中供體PY單獨列為一群，2個受體M540和MF列為一群，供體與2個受體的后代PY-M540和PY-MF單獨列為一群。這說明雜種后代的DNA序列發(fā)生了改變，導(dǎo)致后代與親代間的從屬關(guān)系變成了并列關(guān)系。從擴(kuò)增結(jié)果中后代有Py基因的表達(dá)，表明這種改變極有可能來自豌豆基因的插入。

表2 遺傳距離

表2 遺傳距離

注：1——PY、2——M540、3——MF、4——PY-M540、5——PY-MF。

pop ID 12345****12345****1.475 9 0.965 1 1.286 7 1.098 6****0.363 5 0.405 5 0.405 5****0.495 1 0.297 3****0.259 5

圖3 遺傳距離聚類圖

3 結(jié)論與討論

在異源多倍化早期染色體片斷變化是一個比較普遍現(xiàn)象，這可能有利于實現(xiàn)新合成物種快速進(jìn)化[7]。在染色體分裂的某一特定時期，外源染色質(zhì)的加入導(dǎo)致受體細(xì)胞不能識別，外源染色質(zhì)順利參與了受體細(xì)胞的有絲分裂和減數(shù)分裂，從而出現(xiàn)具有外源核小體與受體核小體兩種核小體形成的螺線體和超螺線體[5]。而這種導(dǎo)入極有可能是因為DNA序列在不同染色體組之間迅速變化所造成，這種DNA序列的變化在具有AABB染色體組的四倍體小麥中注入節(jié)節(jié)麥的DD染色體組形成異源六倍體小麥的早期階段被證實。本試驗利用SRAP引物擴(kuò)增分析表明2個雜交后代的DNA序列也發(fā)生了改變，親本之一的玉米表達(dá)出來的條帶在2個雜種后代中基本都有表達(dá)，較少消失。此外，2個后代還產(chǎn)生了大量的新帶，多數(shù)更與豌豆相似，后代產(chǎn)生的條帶多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于各自的親本，也說明了后代的DNA序列確實發(fā)生了改變。

近年來，作為一種新型分子標(biāo)記，SRAP在物種遺傳多樣性及遠(yuǎn)緣雜交特別是屬間雜交的后代鑒定中得到廣泛應(yīng)用。薛丹丹等[8]利用SRAP標(biāo)記對結(jié)縷草屬雜種后代的鑒定研究表明，雜交后代的基因重組導(dǎo)致擴(kuò)增條帶豐富的變異，表現(xiàn)為條帶的增加或缺失，且后代中有父本特征帶的，鑒定為真實雜種后代。高麗霞等在用SRAP標(biāo)記分析姜花屬間雜交育種時發(fā)現(xiàn)，親緣關(guān)系太近或太遠(yuǎn)（均值0.4～0.6），都會在后代中受自交不親和性影響，而降低結(jié)實率，由此說明遺傳距離的遠(yuǎn)近或許是屬間遠(yuǎn)緣雜交成功的一個重要影響因子。本試驗所用材料是不同綱間的種類雜交，但結(jié)果表明，2個雜種后代除了保持各自受體玉米的特征帶且較少消失外，還產(chǎn)生了大量新帶，其中一些條帶與供體豌豆的特征帶一致，可以證明2個雜交后代DNA序列的改變來自于豌豆基因的插入，是豌豆和玉米的真實雜交后代。

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