謝 放，朱子雄，田 偉，張 楠

（蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

冬蟲夏草是我國(guó)珍稀名貴中藥材之一[1]。前人在其分類與遺傳多樣性方面已經(jīng)做了許多工作[2-4]。但他們對(duì)冬蟲夏草遺傳多樣性的研究，主要依據(jù)RAPD、RFLP、ITS 技術(shù)，而側(cè)重于蟲草 ISSR（Intersimple Sequence Repeats）分子標(biāo)記的研究尚未見報(bào)道。ISSR是由Zietkiewiez等[5]于1994年提出的用于擴(kuò)增2個(gè)距離較近的相鄰SSR位點(diǎn)間序列的一種方法，較RFLP便宜，比RAPD重復(fù)性高，且ISSR多態(tài)性高。此外，它不需要知道被檢測(cè)物種任何基因組的信息，因此ISSR標(biāo)記非常適合基因組信息缺乏物種的研究。自該技術(shù)發(fā)明以來(lái)，已被廣泛應(yīng)用于生物的遺傳多樣性、分子標(biāo)記及農(nóng)作物遺傳多樣性的研究中[6]。本試驗(yàn)旨在明確ISSR-PCR反應(yīng)中各項(xiàng)參數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，建立并優(yōu)化適用于冬蟲夏草的ISSR反應(yīng)體系，為進(jìn)一步研究冬蟲夏草遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

供試物種冬蟲夏草分別采自甘肅省蟲草主要產(chǎn)地：天祝打柴溝鎮(zhèn)東山，甘南合作市合作鎮(zhèn)扎油溝和甘肅漳縣金鐘鎮(zhèn)路骨山。菌種由蘭州交通大學(xué)生物種苗工程研究所分離純化，獲得菌株。

1.1 基因組DNA提取及定量

基因組DNA的提取采用改良的CTAB法[4]：在提取DNA過(guò)程中加入10%β-巰基乙醇防止酚類物質(zhì)被氧化發(fā)生褐變；采用Tris-飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）、氯仿∶異戊醇（24∶1）和 3 mol/L NaAc 溶液（pH 6.0）作為提取液，加速蛋白的變性過(guò)程、鹽類物質(zhì)的沉降以及脂溶性色素的溶解，使獲得的DNA溶液顏色明顯變淺，顯著增加后續(xù)提取的DNA的質(zhì)量。經(jīng)改良后的方法所提取的基因組DNA都比較理想，符合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。

1.2 DNA的定量

將DNA溶于TE緩沖液 [10 mM Tris-HCl,l mM EDTA（pH 8.0）]中，從中取出 10 μL 用 TE 稀釋至2 mL，在紫外分光光度計(jì)下測(cè)量OD260的值，并根據(jù)基因組DNA的濃度值進(jìn)行計(jì)算。最后將樣品濃度調(diào)至20 ng/μL，于-20℃保存?zhèn)溆?，用于ISSR-PCR分析。

1.3 ISSR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序

ISSR引物由上海生工生物工程有限公司合成，dNTP和TaqDNA聚合酶購(gòu)于TaKaRa公司。試驗(yàn)以隨機(jī)選取的835號(hào)引物為固定引物，其序列為：AGAGAGAGAGAGAGAGYC。擴(kuò)增反應(yīng)在PCR反應(yīng)薄壁管中進(jìn)行，利用Biometra公司的梯度PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。

25μL反應(yīng)體系中各反應(yīng)物含量為：20 ng模板DNA，10 mmol/L dNTP，20 μmol/L ISSR 引物，1 U TaqDNA 聚合酶，10×PCR Buffer，25 mmol/L MgCl2。

ISSR-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性 45 s，49℃（48℃～58℃） 退火 45 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保溫。

1.4 PCR檢測(cè)結(jié)果

取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1μL 6×加樣緩沖液（TaKaRa）混勻，點(diǎn)入含10 mg/mL EB的1.2%瓊脂糖凝膠中，于5 V/cm電場(chǎng)強(qiáng)度下電泳1 h，在UVP凝膠成像系統(tǒng)下觀察照相。

1.5 ISSR反應(yīng)條件優(yōu)化

參考紫花苜蓿[8]、鴨茅[9]、檳榔[10]的 ISSR 擴(kuò)增程序和反應(yīng)體系，確定最佳反應(yīng)條件。對(duì)反應(yīng)體系各因素設(shè)置不同梯度水平（表1）。在試驗(yàn)中當(dāng)對(duì)某一因素進(jìn)行梯度設(shè)置時(shí)，其余因素均保持不變。在最佳反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上在梯度PCR儀上進(jìn)行退火溫度篩選，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，篩選出合適的退火溫度。

表1 ISSR反應(yīng)系統(tǒng)優(yōu)化設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA檢測(cè)

經(jīng)0.8%的瓊脂糖電泳、UVP凝膠成像系統(tǒng)下觀察檢測(cè)DNA，所提取的DNA都為一清晰明亮的主帶。再通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260的值，通過(guò)計(jì)算得DNA濃度為50～80 ng/L，DNA質(zhì)量電泳帶無(wú)拖尾現(xiàn)象且圖像較為清晰（圖1），可知所提DNA純度較高，RNA和蛋白質(zhì)含量較少，根據(jù)計(jì)算將DNA濃度調(diào)整為20 ng/μL，于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 DNA模板電泳檢測(cè)圖譜

2.2 Mg2+濃度對(duì)ISSR的影響

增加Mg2+的濃度可以增加Taq DNA聚合酶的擴(kuò)增效率，但會(huì)降低PCR的特異性。從圖2可知當(dāng)Mg2+濃度低于1.5 mmol/L時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物減少甚至沒有；而Mg2+濃度大于1.5 mmol/L時(shí)，譜帶背景變濃且出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，主帶不易分辨且小片段譜帶數(shù)量開始逐漸減少。因此冬蟲夏草ISSR-PCR反應(yīng)中Mg2+最佳濃度為1.5 mmol/L。

圖2 不同Mg2+濃度的電泳圖譜

2.3 dNTP用量對(duì)ISSR的影響

dNTP是ISSR-PCR擴(kuò)增的原料，其濃度直接影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的生成，當(dāng)PCR反應(yīng)在Mg2+濃度為1.5 mmol/L時(shí)隨著dNTP濃度的增大，PCR反應(yīng)增強(qiáng)，特別是較大片段PCR產(chǎn)物反映更為明顯。但隨著dNTP濃度的繼續(xù)增大，PCR反應(yīng)抑制，擴(kuò)增條帶亮度減弱、條帶數(shù)減少。由圖3可知，dNTP濃度低于0.08 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物背景模糊且大片段擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)模糊現(xiàn)象；而高于0.16 mmol/L時(shí)，出現(xiàn)明顯條帶缺失現(xiàn)象。因此冬蟲夏草ISSRPCR反應(yīng)體系中最佳 dNTP濃度為 0.08～0.16 mmol/L。

2.4 Taq DNA聚合酶用量對(duì)ISSR-PCR的影響

圖3 不同dNTP濃度的電泳圖譜

在ISSR-PCR反應(yīng)體系中Taq酶是重要的因子，它的種類、活性與用量關(guān)系到擴(kuò)增反應(yīng)能否正常進(jìn)行。由圖4可知，當(dāng)Taq酶用量為0.5 U時(shí)，獲得了良好的擴(kuò)增效果；當(dāng)Taq酶量大于0.5 U時(shí)，擴(kuò)增條帶產(chǎn)物減少且開始出現(xiàn)彌散現(xiàn)象。可知隨著酶量的增加，PCR擴(kuò)增效果降低，這與一些文獻(xiàn)報(bào)道相同[11]。考慮綜合成本，本研究在25μL反應(yīng)體系中選擇每個(gè)反應(yīng)0.5 U的酶量作為冬蟲夏草ISSR反應(yīng)的最佳酶用量。

圖4 不同酶用量的電泳圖譜

2.5 引物濃度對(duì)ISSR的影響

引物濃度的高低在PCR反應(yīng)中也是重要的影響因素。如圖5所示：1～18泳道均有擴(kuò)增產(chǎn)物，但當(dāng)引物濃度小于0.8μmol/L時(shí)，只有兩條主帶；引物濃度在0.8～1.0μmol/L時(shí)，條帶最清晰穩(wěn)定；大于1μmol/L時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸減少，譜帶不清晰且有彌散現(xiàn)象。故冬蟲夏草ISSR-PCR最佳引物濃度以0.8～1.0μmol/L為宜。

圖5 不同引物濃度的電泳圖譜

2.6 模板DNA用量對(duì)ISSR-PCR的影響

良好的模板質(zhì)量和濃度是保證PCR特異性擴(kuò)增的前提。由圖6可知，模板用量為15～20 ng時(shí)，均能產(chǎn)生清晰擴(kuò)增條帶，而20 ng時(shí)譜帶更清晰，模板量在30～50 ng時(shí)，隨著模板量的增加，擴(kuò)增的譜帶亮度反而減弱，只有少量主帶較亮。因此在冬蟲夏草ISSR-PCR反應(yīng)中，DNA最佳用量為20 ng。

圖6 不同模板用量的電泳圖譜

2.7 退火溫度對(duì)ISSR-PCR的影響

運(yùn)用Biometra公司的梯度PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，圖7為835號(hào)引物進(jìn)行的退火溫度梯度試驗(yàn)。從圖7中可知當(dāng)退火溫度在49.6～52.0℃之間時(shí)擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定。低于或高于此范圍都將不出帶或出現(xiàn)弱帶現(xiàn)象。因此試驗(yàn)中835號(hào)引物最佳退火溫度選擇為50.8℃。

圖7 835號(hào)ISSR引物不同退火溫度電泳圖譜

3 討論

ISSR-PCR擴(kuò)增中DNA模板的質(zhì)量是決定擴(kuò)增效果的重要因素，在一定范圍內(nèi)隨著模板量的增加，PCR擴(kuò)增的條帶數(shù)隨之增加；但隨著模板量的繼續(xù)增加，擴(kuò)增條帶數(shù)減少即小片段產(chǎn)物減少，非特異性增強(qiáng)。為保證有較好的特異性，引物與模板的結(jié)合程度和結(jié)合量也要保持適當(dāng)?shù)谋壤Ｔ囼?yàn)得出在模板量不變的條件下，引物濃度低時(shí)有利于大片段的擴(kuò)增，引物濃度高時(shí)則更有利于小片段的擴(kuò)增。

Mg2+對(duì)擴(kuò)增結(jié)果也起到重要的影響。Taq DNA聚合酶的活性離不開Mg2+，Mg2+通過(guò)影響酶進(jìn)而影響PCR結(jié)果。Mg2+濃度過(guò)低時(shí)酶的活性得不到提高，過(guò)高時(shí)酶的活性又會(huì)受到抑制。同時(shí)由于溶解DNA的緩沖液TE中含有EDTA，會(huì)螯合Mg2+；加上dNTP中的磷酸基團(tuán)能和Mg2+結(jié)合，使反應(yīng)體系中Mg2+的實(shí)際濃度降低，進(jìn)而降低Mg2+濃度以致影響酶活性。

試驗(yàn)得出，引物的退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果有明顯的影響。不同的引物具有不同的最適退火溫度，需要進(jìn)行逐一篩選以獲得較為穩(wěn)定的標(biāo)記結(jié)果。在運(yùn)用的10條引物中各引物的退火溫度表現(xiàn)出了相同的趨勢(shì)即退火溫度低于或高于最適退火溫度時(shí)都會(huì)出現(xiàn)缺帶或弱帶的現(xiàn)象。

4 結(jié)論

在反應(yīng)體系中各組分的含量和擴(kuò)增條件的選擇都會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響。在建立反應(yīng)體系時(shí)為了得到可靠的、穩(wěn)定的、重復(fù)性好的擴(kuò)增結(jié)果，同時(shí)從經(jīng)濟(jì)角度考慮，在得到相同試驗(yàn)結(jié)果的條件下，應(yīng)選擇藥品用量少的反應(yīng)體系組成。最后，本試驗(yàn)確立了冬蟲夏草ISSR-PCR反應(yīng)25μL體系為：10×PCR Buffer 2.5μL；模板DNA 20 ng；ISSR 引物0.9μmol/L；dNTP 0.12 mmol/L；Mg2+1.5 mmol/L；Taq DNA 聚合酶0.5 U。

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