王亮 許紹發(fā) 岳文濤 趙曉婷 張麗娜 王玥

肺癌是當(dāng)今世界上嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤，我國(guó)衛(wèi)生部2008年5月公布的數(shù)據(jù)表明，肺癌是我國(guó)惡性腫瘤中致死的首要因素。肺癌發(fā)生的分子機(jī)制尚未明了，癌基因的激活及抑癌基因的缺失和（或）突變以及DNA修復(fù)基因突變和（或）缺失是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的主要原因。研究表明：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammal target of rapamycin, mTOR）是控制蛋白翻譯和細(xì)胞周期進(jìn)展的重要調(diào)控因子，處于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)，它控制細(xì)胞內(nèi)mRNA的翻譯，參與膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)降解、蛋白激酶C信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和核糖體合成等一系列生理病理過程。mTOR作為介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、增生、分化、代謝的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路，通路的失調(diào)可能對(duì)肺癌形成具有重要的作用[1,2]。第10染色體丟失的磷酸酶基因（phosphatase and tensinhomologue deleted on chromosome 10, PTEN）是Li等[3]發(fā)現(xiàn)的同時(shí)具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因。這一基因定位于染色體10q23，有9個(gè)外顯子，編碼403個(gè)氨基酸組成的蛋白。在大多數(shù)腫瘤中包括肺癌，PTEN基因常有異常改變，提示PTEN基因異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的作用。PTEN基因作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有雙重特異性磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、凋亡、遷移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起著重要的調(diào)控作用。而突變的PTEN失去了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控，可導(dǎo)致腫瘤進(jìn)行性生長(zhǎng)[4]。PTEN功能丟失可激活mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與腫瘤的發(fā)生[5]。mTOR和PTEN二者與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。因此，本實(shí)驗(yàn)以mTOR通路中的兩個(gè)重要基因mTOR和PTEN為觀察指標(biāo)，通過檢測(cè)NSCLC組織和癌旁組織中上述基因的表達(dá)變化，觀察mTOR和PTEN的活化在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中的表達(dá)以及二者的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌組織取自2007年4月-2008年10月北京胸科醫(yī)院手術(shù)標(biāo)本65例，鱗癌38例，腺癌27例，其中高分化5例，中分化43例，低分化例17例。臨床分期，依據(jù)1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，其中I期-II期38例，III期-IV期27例。全組男55例，女10例，中位年齡60歲，其中＜60歲組31例，≥60歲組34例，年齡最大84歲，最小36歲。所有患者術(shù)前均未經(jīng)任何化療和抗腫瘤治療，經(jīng)臨床及病理學(xué)檢查確診為NSCLC。同時(shí)取癌旁組織30例設(shè)為對(duì)照，進(jìn)行配對(duì)研究。所有組織標(biāo)本采集后迅速液氮保存?zhèn)錂z。

1.2 mTOR、PTEN基因mRNA表達(dá)水平的測(cè)定

1.2.1 試劑 Trizol、DEPC購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，dNTP、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、瓊脂糖等為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品，RNasina Ribonuclease Inhibitor購(gòu)自華美生物工程公司，DNA Markers II (100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1 000 bp、2 000 bp) 購(gòu)自北京Tiangen公司，引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 方法 30 mg肺癌或正常組織，用Trizol一步法提取總RNA，經(jīng)電泳顯示28S、18S和5S清晰三條帶，測(cè)定OD260/OD280比值1.8-2.0。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）檢測(cè)mTOR、PTEN基因mRNA表達(dá)水平，兩個(gè)基因的引物序列見表1。RT反應(yīng)體系20 μL， PCR反應(yīng)體系25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95oC預(yù)變性5 min，94oC變性30 s，XoC退火30 s，72oC延伸40 s，循環(huán)35次，72oC終末延10 min。模板量及循環(huán)數(shù)經(jīng)檢測(cè)均在線性范圍內(nèi)。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，以Gel Pro Analyzer 4.0計(jì)算機(jī)圖像掃描分析系統(tǒng)測(cè)定電泳條帶密度值，以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算mTOR、PTEN基因mRNA的相對(duì)含量，結(jié)果以mTOR、PTEN條帶占β-actin條帶中央點(diǎn)密度的百分率（%）表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0與Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量的Mean±SD表示，采用t檢驗(yàn)分析目標(biāo)基因在NSCLC組織和癌旁組織中，以及不同病例信息之間的表達(dá)量，Kendall's taub相關(guān)性分析目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量之間的相關(guān)性，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA純度檢測(cè)和濃度測(cè)定 將提取的肺癌組織及癌旁組織的總RNA進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果顯示5S、18S、28S三條清晰條帶（圖1），表明所得RNA完整性較好；再經(jīng)紫外分光光度儀確定所得RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間，說明RNA無蛋白污染，符合RT-PCR實(shí)驗(yàn)要求。最后，通過OD260值計(jì)算RNA濃度，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

2.2 癌組織及癌旁組織中mTOR、PTEN基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 研究中通過瓊脂糖凝膠對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)（圖2），肺癌與癌旁組織中β-actin表達(dá)水平一致，對(duì)電泳條帶密度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：mTOR在NSCLC組織中表達(dá)量（0.23±0.16）顯著高于癌旁組（0.12±0.09）（P＜0.01），PTEN在NSCLC組織中表達(dá)量（0.19±0.28）顯著低于癌旁組（0.53±0.28）（P＜0.01）。

表 1 目標(biāo)基因的引物設(shè)計(jì)Tab 1 Primers for two genes

2.3 mTOR、PTEN基因的表達(dá)水平與NSCLC患者臨床特征的關(guān)系 mTOR、PTEN基因的表達(dá)水平與NSCLC患者的年齡、性別、病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系，但與腫瘤大小有顯著關(guān)系（表2）。

2.4 mTOR與PTEN相關(guān)性分析 肺癌組織中mTOR、PTEN基因相對(duì)表達(dá)量的ROC曲線分析結(jié)果（圖3），AUC（area under the curve）值均＞0.5，說明這些曲線具有診斷意義。mTOR、PTEN基因相對(duì)表達(dá)值的散點(diǎn)圖cut-off值見圖4，虛線表示這兩個(gè)基因?yàn)樵\斷標(biāo)準(zhǔn)。兩個(gè)基因的cutoff值均為0.38，選定敏感性和特異性分別為64%/66%、89%/73%，當(dāng)然此cut-off值也取決于敏感性特異性相對(duì)值的選取。使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行Kendall's taub非參數(shù)相關(guān)性分析來研究?jī)蓚€(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示：mTOR與PTEN的相對(duì)表達(dá)量之間呈負(fù)相關(guān)。隨著腫瘤的發(fā)展，PTEN的表達(dá)水平呈遞減趨勢(shì)。

3 討論

圖 1 肺組織總RNA提取Fig 1 Total RNA of lung tissues

表 2 臨床病理參數(shù)與兩個(gè)基因表達(dá)之間的關(guān)系Tab 2 The relationship of clinicopathological parameters and two gene expressions

圖 2 目標(biāo)基因的擴(kuò)增。T泳道為癌組織；N泳道為癌旁組織。Fig 2 The amplification of target genes, mTOR、PTEN、β-actin are in order.T are from tumor tissues; N are from tumor adjacent tissues.

圖 3 mTOR和PTEN基因表達(dá)量的曲線分析Fig 3 The ROC curve analysis of the mTOR, PTEN gene expressions. A:The ROC curve analysis of the mTOR gene expression, AUC=0.771; B:The ROC curve analysis of the PTEN gene expression, AUC=0.894.

圖 4 mTOR、PTEN基因相對(duì)表達(dá)水平的散點(diǎn)圖Fig 4 Scatter distribution of relative expressions of mTOR, PTEN gene. A: Scatter distribution of relative expression of mTOR gene; B: Scatter distribution of relative expression of PTEN gene.

NSCLC是當(dāng)今最常見的惡性腫瘤之一，目前對(duì)NSCLC的治療方法還是傳統(tǒng)的手術(shù)、化療和放療，但是5年生存率仍僅為10%-15%，其中大部分病人經(jīng)確診時(shí)已是中晚期，失去了治療機(jī)會(huì)。所以，早發(fā)現(xiàn)早治療成為提高5年生存率的關(guān)鍵。近年來，隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，人們一直在尋找一種更好的肺癌標(biāo)志物，mTOR信號(hào)通路在人類腫瘤的作用得到了廣泛的關(guān)注。mTOR信號(hào)通路的活化在人類腫瘤的發(fā)生中極為普遍，該通路可以通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，包括基因突變、抑癌基因PTEN的表達(dá)減少、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）的擴(kuò)增、癌基因受體的活化等[6,7]。mTOR在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如卵巢癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等癌組織中均有mTOR的過度表達(dá)及活化[8]。mTOR基因在肺癌及侵襲前支氣管病變中均表現(xiàn)為基因組的擴(kuò)增，這提示mTOR通路與肺癌的發(fā)展有關(guān)[9]。PTEN基因主要通過調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞周期來發(fā)揮抑癌作用，主要功能為抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞粘附、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞骨架形成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)血管生成[10]。PTEN基因具有磷酸酶活性，其蛋白具有脫磷酸作用，磷脂酰肌醇3磷酸（phosphatidylinositol-3, PIP3）脫磷酸形成磷脂酰肌醇2磷酸（phosphatidylinositol-2, PIP2），使其喪失信使功能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，mTOR在NSCLC組織中表達(dá)量顯著高于癌旁組，PTEN在NSCLC組織中表達(dá)量顯著低于癌旁組織，與Lim等的報(bào)道一致[11]。在本實(shí)驗(yàn)中mTOR、PTEN基因的表達(dá)水平同NSCLC患者的腫瘤大小有顯著關(guān)系，PTEN在NSCLC發(fā)展過程中的表達(dá)缺失呈現(xiàn)一種逐漸升高的進(jìn)行性變化趨勢(shì)，并逐漸喪失其抑癌功能。PTEN在III期NSCLC中表達(dá)顯著低于I期NSCLC，提示PTEN基因表達(dá)缺失可能是NSCLC發(fā)展過程中的晚期事件之一。但近期有實(shí)驗(yàn)證實(shí)PTEN失活可加速小鼠肺癌模型中腫瘤的形成，從而提示肺癌形成早期即有PTEN失活。在本實(shí)驗(yàn)中mTOR、PTEN基因的表達(dá)水平同NSCLC患者的年齡、性別、病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系，與個(gè)別報(bào)道不符，究其原因可能與研究對(duì)象的臨床病理特征組成不同、mTOR和PTEN陽(yáng)性的判斷方法不同有關(guān)。另外，在一些指標(biāo)中P值接近0.05，考慮可能時(shí)由于本實(shí)驗(yàn)樣本量較小，若加大樣本量可能會(huì)有差異。PTEN的缺失或低表達(dá)失去了對(duì)mTOR的抑制作用，使得mTOR過度表達(dá)。兩者共同促進(jìn)NSCLC的發(fā)展，相關(guān)性分析表明：兩者呈負(fù)相關(guān)。說明PTEN的失活與mTOR的高表達(dá)在NSCLC的生長(zhǎng)增殖中起一定的作用，并且關(guān)系密切。PTEN通過抑制PIP3的活化，使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，而mTOR的活化可促使該進(jìn)程的發(fā)展。PTEN是一種抑癌基因，可以逆轉(zhuǎn)mTOR所催化的反應(yīng)，可介導(dǎo)的細(xì)胞增殖，是mTOR通路中的一個(gè)負(fù)向調(diào)節(jié)因子，PTEN的腫瘤抑制功能主要依賴其脂質(zhì)磷酸酶的活性，它可通過特異性地促使PIP3的脫磷酸化，使之轉(zhuǎn)化為PIP2，使PIP3無法激活下游的AKT，從而起不到抑制AKT/mTOR通路的活性的作用，mTOR通路活性增強(qiáng)，下游的核糖體蛋白S6（ribosomal protein S6, RPS6）、p70核糖體S6激酶（P70 ribosomal S6 kinase）、真核生物翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein, 4EBP）等相關(guān)效應(yīng)蛋白隨之增強(qiáng)[12]。自PTEN基因被發(fā)現(xiàn)至今，其作為一種腫瘤抑制基因，PTEN在多種腫瘤中的高頻率的雜合性丟失，被認(rèn)為是后p53時(shí)代突變最多的腫瘤抑制基因，mTOR和PTEN在生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路扮演著非常重要的角色，mTOR和PTEN的聯(lián)合檢測(cè)可作為診斷NSCLC的重要腫瘤標(biāo)志物。