魏淑珍 孫宇 楊志堅 宋勇

肺癌已成為全球癌癥死亡的首要原因。即使積極行局部和全身治療，多數(shù)患者仍死于肺癌轉(zhuǎn)移。因此這一現(xiàn)狀向肺癌基礎(chǔ)研究提出了挑戰(zhàn)，需要研發(fā)更多更新的治療方法來提高診斷和治愈率。肺癌動物模型的發(fā)展可能會幫助理解肺癌的腫瘤生物學特性，促進早期診斷方法和新的治療方法的研究。動物肺癌移植瘤模型分為皮下移植模型和原位移植模型[1]。目前用于研究的模型多是皮下移植模型，但皮下移植的腫瘤屬于異位種植，脫離了其起源組織器官的微環(huán)境。許多腫瘤的轉(zhuǎn)移表型是在原位種植后才能表達，因此應(yīng)用此模型得到的實驗結(jié)果與臨床應(yīng)用的實際效果之間常有較大的差異。原位種植肺癌動物模型應(yīng)用腫瘤細胞懸浮液行氣管內(nèi)、胸內(nèi)、靜脈注射，或者將新鮮腫瘤組織塊手術(shù)原位種植至免疫缺陷動物呼吸系統(tǒng)的組織內(nèi)。該模型可提高成瘤率，具有較強的侵襲及轉(zhuǎn)移特性[2]。相關(guān)實驗還證明，在肺癌原位移植模型中，瘤塊外科原位移植法（surgical orthotopic implantation, SOI）[3]比腫瘤細胞懸液原位注射法（cellular orthotopic injection, COI）[4]轉(zhuǎn)移率高，其轉(zhuǎn)移的發(fā)生具有與臨床相似的時間依賴性。

近年來，熒光蛋白的深入研究及原位動物模型的廣泛應(yīng)用使在體腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的非侵入性實時成像成為現(xiàn)實。將熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染至腫瘤細胞，追蹤體內(nèi)腫瘤細胞中熒光蛋白的表達，可實時監(jiān)測原發(fā)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，在細胞和分子水平對活體內(nèi)的生理和病理過程進行定性或定量可視化觀察?；铙w熒光顯像技術(shù)為直接觀察腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移、血管生成和腫瘤細胞與宿主微環(huán)境的相互作用等生物學行為及直接客觀評價抗腫瘤藥物療效提供了重要的手段。目前國內(nèi)該技術(shù)在肺癌方面的研究報道也僅限于皮下模型[5]和COI[6]，而SOI法建立的肺癌模型未見報道。因此本研究采用SOI法將穩(wěn)定、高表達EGFP的人肺癌細胞系NCI-H460原位移植，建立肺癌裸鼠原位移植模型，并應(yīng)用小動物活體熒光成像系統(tǒng)觀察腫瘤的生長，探討其生物學特性，以期建立一個理想的動物模型用于研究肺癌的轉(zhuǎn)移和臨床前期藥物研發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人非小細胞肺癌NCI-H460：購自美國ATCC（American Type Culture Collection美國組織細胞庫）。

1.1.2 EGFP表達載體 PT67包裝細胞內(nèi)含新霉素耐藥基因的pLEIN-EGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒，由美國Anticancer公司Hoffman博士惠贈。

1.1.3 實驗動物 BALB/c（nu/nu）裸鼠，雌雄不限。4周齡-6周齡，22只，體重18 g-22 g。所有裸鼠在SPF級屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)并進行實驗（實驗室使用許可證編號：SYXK（蘇）2007-0011）。飼養(yǎng)室相對濕度為（55±10）%，溫度為（22±2）oC，光照12 h明暗交替，裸鼠飼養(yǎng)用的飼料為鈷60輻射滅菌過的大小鼠專用顆粒飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 表達綠色熒光蛋白的H460肺癌細胞系的建立 在含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素的RPM1-1640上清液中培養(yǎng)PT67包裝細胞。當細胞達到80%-90%融合濃度時收集培養(yǎng)液，經(jīng)孔徑為0.45 μm的醋酸纖維濾膜過濾后備用。轉(zhuǎn)染前24 h更新NCI-H460新鮮培養(yǎng)基，加入含逆轉(zhuǎn)錄病毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染4 h后，置于37oC孵育箱孵育36 h，在熒光顯微鏡下觀察熒光。收集轉(zhuǎn)染細胞，在含200 μg/mL的G418選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。逐步將G418濃度增加200 μg/mL-400 μg/mL，直至抗性克隆形成。用96孔板單個細胞分離方法分離高表達GFP的克隆株，混合分離克隆株，使用常規(guī)方法擴增。經(jīng)體外連續(xù)傳代培養(yǎng)3個月，檢測熒光的表達強度。

1.2.2 原位移植模型的建立 將H460-GFP細胞懸浮于PBS液中，調(diào)整細胞濃度為5×106/mL。消毒裸鼠左側(cè)腋下皮膚，將0.2 mL細胞懸液用1 mL帶有27G1/2針頭的注射器接種于2只裸鼠皮下，形成一皮丘，干棉簽壓迫。當皮下移植瘤長至直徑約10 mm時剝?nèi)∫浦擦觯x擇生長良好、瘤結(jié)無破潰的荷瘤裸鼠，在凈化工作臺內(nèi)，無菌操作下完整剝離瘤結(jié)，生理鹽水洗去血漬。剪開瘤結(jié)，清除中心的壞死組織，剪成直徑約1 mm大小的米粒樣小瘤塊。20只裸小鼠接受外科原位移植術(shù)。異氟烷吸入麻醉，將裸鼠置于右側(cè)臥位，四肢適當固定。消毒左側(cè)胸壁皮膚，在近第4、5肋間位置的皮膚切一0.4 cm-0.5 cm的橫切口，銳性分離胸壁肌肉，暴露肋骨和肋間肌，打開胸腔。用鑷子固定左肺，將準備好的瘤塊縫合在左肺上，無菌縫合線縫合關(guān)閉胸腔。立即檢查縫合情況，如果漏氣，繼續(xù)縫合，直至胸壁完全縫合。用5 mL注射器做胸腔內(nèi)穿刺抽氣，縫合胸壁肌肉和皮膚。裸鼠放回原飼養(yǎng)籠，繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.2.3 監(jiān)測指標 術(shù)后每天觀察裸鼠有無并發(fā)癥及異常情況（活動，神經(jīng)功能，呼吸，動物外觀）。腫瘤種植后每周麻醉處死2只裸鼠，共4周。銳性分離左側(cè)皮膚肌肉。在熒光體視顯微鏡下打開胸腔和腹腔，分別在自然光源和熒光激發(fā)狀態(tài)下拍照。使用小動物活體成像系統(tǒng)檢測GFP的表達，發(fā)射波長為520 nm，激發(fā)波長為480 nm，曝光時間為1 s，IPP軟件定量分析熒光面積。觀察原位移植瘤生長情況，經(jīng)典方法測量腫瘤體積：用游標卡尺測量腫瘤的最長徑（a）和與之垂直的最短徑（b），根據(jù)公式計算腫瘤體積：腫瘤體積（V）=ab2/2（a、b以mm為單位）。以腫瘤接種天數(shù)為橫坐標，腫瘤接種部位熒光面積為縱坐標，繪制原位腫瘤生長曲線。

其余裸鼠每周打開胸部皮瓣，戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉裸鼠，或者用手固定裸鼠，在自然光源和熒光激發(fā)狀態(tài)下拍照。當裸鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)后，解剖荷瘤鼠，肉眼觀察腫瘤生長情況及周圍臟器受累情況，并拍照。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，熒光面積和腫瘤體積用Mean±SD表示，Pearson相關(guān)性檢驗分析活體腫瘤面積與腫瘤體積之間的相關(guān)性，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFP標記的NCI-H460細胞的生物學特性 EGFP標記的NCI-H460細胞為多邊形上皮樣細胞，貼壁生長，熒光顯微鏡觀察可見細胞表達的熒光信號較強，轉(zhuǎn)染率接近100%，細胞在體外能夠穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白，并且隨體外長期傳代培養(yǎng)無明顯消退（圖1）。

2.2 活體熒光成像動態(tài)觀察裸鼠原位移植瘤的生長 接受外科原位移植術(shù)的裸鼠，術(shù)中死亡4只，安全度過手術(shù)期的16只裸鼠均完成實驗。肺癌原位移植后成瘤率為100%。第7天可活體觀察到肺癌原位移植瘤熒光，第3周左右出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，第28天左側(cè)胸腔被腫瘤占據(jù)（圖2）。應(yīng)用小動物活體熒光成像系統(tǒng)和胸部皮瓣可連續(xù)監(jiān)測綠色熒光蛋白在裸鼠肺部的表達，隨著腫瘤移植時間的增加，表達綠色熒光蛋白面積逐漸增大（圖3）。用于觀察生存期的8只裸鼠在30天-35天自然死亡，平均生存期為34.2天，稱取裸鼠原位移植瘤質(zhì)量，平均瘤重為（0.66±0.25）g，最大者為1.11 g，最小者為0.52 g。處死裸鼠后，行大體觀察及熒光顯微鏡下觀察，可見不同程度的轉(zhuǎn)移。與光學成像相比，熒光顯像對小的轉(zhuǎn)移灶顯像較為清晰（圖4）。7只裸鼠出現(xiàn)右肺轉(zhuǎn)移，6只出現(xiàn)縱隔、肺門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，2只出現(xiàn)胸腔積液，1只出現(xiàn)膈肌轉(zhuǎn)移，而肝、腎、腎上腺、骨骼未見腫瘤浸潤。對側(cè)肺、縱隔及肺門淋巴結(jié)、胸膜和膈肌的轉(zhuǎn)移率分別為87.5%、75%、25%和12.5%。

2.3 裸鼠肺癌原位移植瘤的熒光定量及腫瘤生長曲線的繪制 處死裸鼠后取出原發(fā)灶，在熒光體視顯微鏡下拍照記錄并按常規(guī)方法測量計算腫瘤體積。經(jīng)過后期IPP軟件處理原位移植瘤熒光面積，對熒光面積和腫瘤體積進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明原位腫瘤熒光面積與腫瘤體積具有相關(guān)性（r=0.873, P=0.001）（圖5）。根據(jù)腫瘤面積繪制原位移植瘤生長曲線，可見腫瘤在第2周-第4周生長較快，4周后腫瘤因局限在胸腔內(nèi)生長，增長速度減慢（圖6）。

3 討論

體內(nèi)移植模型是腫瘤實驗研究的主要方法。1969年Rygaard等[7]首次成功地在裸小鼠中移植人結(jié)腸癌以后，人們開始利用裸小鼠進行腫瘤移植的研究。皮下移植動物模型及轉(zhuǎn)基因動物模型均不能很好地體現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)移和藥物敏感性。1991年Fu等[8]創(chuàng)立了外科原位移植方法，它采用的移植物直接來自新鮮外科標本或者移植性人腫瘤細胞或瘤細胞系，通過手術(shù)將腫瘤原位移植至裸鼠體內(nèi)建立腫瘤模型。眾多學者通過前列腺癌[9]、胰腺癌[10]、乳腺癌等原位移植瘤的動物實驗?zāi)Ｐ妥C實原位移植模型技術(shù)是一種巨大的進步，它的轉(zhuǎn)移率和轉(zhuǎn)移模式更接近于臨床。

1994年Chalfie等[11]首次在大腸埃希菌和線蟲中表達GFP，開創(chuàng)了GFP應(yīng)用研究的先河。近年來，綠色熒光蛋白已成為應(yīng)用最為廣泛的標記性蛋白質(zhì)之一。GFP基因表達的綠色熒光蛋白受到藍光或紫光照射時可自發(fā)地發(fā)出綠色熒光，熒光信號強度高，易于被捕獲，無需其它底物或輔助因子的協(xié)助便可直接通過熒光顯微鏡或流式細胞儀等進行檢測，觀察直觀方便；同時，還具有穩(wěn)定性好、耐受性強、對組織或細胞無毒性和易于構(gòu)建載體等優(yōu)點。因此，GFP在腫瘤的生長、療效評價等方面均已獲得廣泛應(yīng)用。

圖 1 穩(wěn)定表達EGFP的H460細胞單克?。ā?00）。A：熒光顯微鏡；B：倒置顯微鏡。Fig 1 Stable and high-level of EGFP expression in H460 cells in vitro. A: Image of NCI-H460-EGFP cells visualized with an inverted fluorescence microscopy; B: Image of (A) visualized with an inverted microscopy.

圖 2 裸鼠原位種植瘤的活體熒光成像動態(tài)觀察（Bar, 5 mm）。肺癌原位移植后成瘤率為100%，第7天可活體觀察到肺癌原位移植瘤的熒光表達，第21天左右出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，第28天左右裸鼠開始出現(xiàn)消瘦、活動減退、呼吸短促等癥狀，腫瘤布滿整個左側(cè)胸腔。Fig 2 Dynamic observation of fluorescence imaging in nude mice bearing tumor (Bar, 5 mm). Tumor formation rate was 100% after surgical orthotopic implantation. Green fluorescence in situ can be observed at day 7. Metastases occurs around day 21.At day 28, nude mice appeared emaciated, shortness of breath and other symptoms. Tumor in situ filled the entire left chest.

圖 3 裸鼠原位腫瘤的活體連續(xù)觀察。A：第7天； B：第14天；C：第21天 。Fig 3 Continuous observation of orthotopic tumors in vivo. A: Day 7; B: Day 14; C: Day 21.

圖 4 裸鼠自然死亡腫瘤的解剖觀察。A、B：熒光成像；C、D：大體照片。整體熒光成像對微小轉(zhuǎn)移灶顯像比自然光下大體照片顯像更為清晰。Fig 4 Observation of nude mouse after thoracic anatomy. A, B: Fluorescence imaging; C, D: The general picture. Compared to the general picture, the fluorescence imaging is more clear to detect minor tumours.

圖 5 原位腫瘤熒光面積和腫瘤體積之間的相關(guān)性分析。原位腫瘤熒光面積和腫瘤體積具有顯著相關(guān)性（r=0.873, P＜0.05）。Fig 5 The correlation analysis between tumor volume and green fluorescent area during tumor proliferation. Significant correlation(r=0.873, P＜0.05) was observed between tumor volume and green fluorescent area.

活體動物體內(nèi)光學成像技術(shù)將GFP基因直接轉(zhuǎn)染至腫瘤細胞，根據(jù)熒光蛋白的觀測和定量分析直接反映研究細胞的生物學特性。熒光蛋白內(nèi)在的生色團，在簡單的儀器如帶有窄帶過濾片和激發(fā)濾波片的藍色發(fā)光二極管照射下，能發(fā)射藍色激發(fā)光，激發(fā)熒光蛋白發(fā)光。觀察者通過合適的看片燈和約490 nm波長的導(dǎo)光纖維光源，可直接肉眼觀察大腫塊的熒光顯影。對于微小腫瘤轉(zhuǎn)移灶，可以通過熒光解剖顯微鏡來觀察。可調(diào)過濾器可將皮膚自發(fā)熒光的干擾降至最低，排除宿主自身熒光的干擾。活體成像技術(shù)在肺癌方面也有大量深入的研究，前期的研究主要集中在腫瘤轉(zhuǎn)移規(guī)律方面。Yang等[12]將GFP標記的肺癌細胞注射入裸鼠的尾靜脈，利用整體成像系統(tǒng)觀察了廣泛骨轉(zhuǎn)移的過程。Kondo等[13]將GFP標記的6種肺癌細胞株原位移植于重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠，觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移途徑及轉(zhuǎn)移部位，3株出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移，3株出現(xiàn)血行轉(zhuǎn)移，其中A549株出現(xiàn)多個部位轉(zhuǎn)移，Mat株出現(xiàn)單個部位轉(zhuǎn)移。

本實驗通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，將編碼EGFP的基因轉(zhuǎn)入NCI-H460細胞系，通過G418篩選和有限稀釋法，獲得一株細胞生物學行為無明顯改變的、穩(wěn)定表達綠色熒光的肺癌細胞株NCI-H460-EGFP，并使用外科原位移植技術(shù)建立裸鼠原位移植模型，模擬了人肺癌的生長和轉(zhuǎn)移條件。術(shù)后第4周-第5周，裸鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)的表現(xiàn)：消瘦、食欲下降、弓背、呼吸短促。處死后解剖發(fā)現(xiàn)肺部腫瘤生長，并發(fā)生了廣泛的轉(zhuǎn)移。但本實驗未觀察到骨骼、頭顱等轉(zhuǎn)移病灶，可能因為原位移植后肺部原發(fā)腫瘤生長，未有遠處轉(zhuǎn)移時裸鼠即因肺部病變而死亡。

圖 6 以熒光面積為觀察指標為觀測指標繪制的生存曲線。第1周-第4周，隨著移植時間的增加，表達綠色熒光蛋白的面積逐漸增大，4周后，熒光面積增長速度明顯減慢。Fig 6 The tumor growth of NCI-H460-EGFP cells and dynamic change of fluorescent area. After the establishment of orthotopic model,the area of green fluorescent protein expression of tumor increased gradually during 1 week to 4 weeks. But after 4 weeks, the growth of fluorescent area has slowed significantly.

原位移植法建立的模型為體內(nèi)深部組織生長，腫瘤生長和播散的測量和評價較為困難。常規(guī)采用每隔幾天處死一定數(shù)量裸鼠后行病理分析，以檢測腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移?；铙w熒光成像系統(tǒng)無需處死裸鼠即可實現(xiàn)對淺表腫瘤的生長、體內(nèi)的播散及遠處轉(zhuǎn)移的體外實時監(jiān)測。2003年Katz等[14]建立表達紅色熒光蛋白的胰腺原位裸鼠模型，分別獲取活體測得腫瘤熒光面積和經(jīng)典方法測得的腫瘤體積，證明兩者密切相關(guān)。成像系統(tǒng)通過熒光面積客觀描述腫瘤體積的生長，所得數(shù)據(jù)與腫瘤體積相對應(yīng)。而復(fù)旦大學肝癌研究所建立的肝癌原位移植模型分析熒光積分光密度（integrated optical density, IOD）和腫瘤體積之間的相關(guān)關(guān)系，認為熒光IOD值更能評估腫瘤體積[15]。IOD值，又稱積分吸光度，為所測結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)各像素光密度值之和，表達不僅與體積相關(guān)，還與功能相關(guān)。腫瘤壞死部分不分泌熒光蛋白，故IOD值實質(zhì)上是有功能的活細胞光密度的總和。肺癌原位移植為深部腫瘤，拍照時可因為光線、角度等不同，同一腫瘤而得出不同的熒光IOD值，造成偏差。而熒光面積計算方便，本研究的相關(guān)性檢驗分析結(jié)果顯示熒光面積和體積存在較強的相關(guān)性。所以本研究采用熒光面積代替腫瘤體積繪制腫瘤生長曲線來分析腫瘤生長和轉(zhuǎn)移情況。因此，肺癌原位移植模型結(jié)合了原位移植和綠色熒光蛋白的優(yōu)點，可在同一只裸鼠身上達到連續(xù)觀察的效果。

對于肺癌等體內(nèi)深部腫瘤，熒光活體成像在肺癌原位觀察仍存在一定的問題：EGFP的發(fā)射波長為520 nm，易被周圍組織散射，所以在成像深度方面尚有一定缺陷。肺部腫瘤GFP激發(fā)出的熒光不能穿透皮膚和胸壁，必須暴露成像，打開皮窗，且無法觀察內(nèi)臟器官的遠處轉(zhuǎn)移[16]。隨著研究人員對熒光蛋白的深入探討，發(fā)現(xiàn)發(fā)射光譜在近紅外波段的熒光蛋白更適合深部動物組織成像。紅色熒光蛋白產(chǎn)生的熒光顯像將更敏感，周圍組織的吸收和散射減少。目前已發(fā)現(xiàn)的最亮的熒光蛋白是一種叫Katushka的紅色熒光蛋白，發(fā)射波長超過620 nm，具有快速成熟、高pH穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性的特點，將來可能會使肺部腫瘤活體動物的非侵入全身成像成為現(xiàn)實[17,18]。

綜上所述，本實驗利用SOI法構(gòu)建的表達綠色熒光蛋白的肺癌裸鼠原位模型，通過觀察綠色熒光蛋白能夠客觀評價NCI-H460-EGFP細胞在裸小鼠體內(nèi)的生長情況，從而發(fā)現(xiàn)肉眼無法發(fā)現(xiàn)的微小轉(zhuǎn)移灶，在探索肺癌的生長、轉(zhuǎn)移等機制的研究中有重要的價值。同時本研究還證實了在該模型中可以通過測量熒光面積推測腫瘤體積，從而定量分析腫瘤在體內(nèi)的生長情況，為藥物治療的臨床前研究提供新的實驗工具。