徐小濤 陸曉 孫婧 束永前

腫瘤干細胞是腫瘤細胞群體中一小部分具有自我更新和多向分化能力的起始細胞，這部分細胞對放化療耐受，轉移潛力高，也是腫瘤異質(zhì)性形成的主要原因[1]。側群細胞（side population cell, SP cell）是1996年Goodell等[2]利用Hoechst染料通過流式細胞術進行造血干/祖細胞分離時發(fā)現(xiàn)的一群特殊細胞?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)SP細胞廣泛分布于多種成體組織、胚胎和多種腫瘤細胞中，具有類似干細胞的自我更新能力和多向分化潛能。由于腫瘤干細胞表面高表達ABCG2轉運體，能夠高效外排熒光染料Hoechst 33342，可以通過流式細胞儀來分選。Ho等[3]研究證明肺癌SP細胞具有更高的致瘤性和化療抵抗性，具有腫瘤干細胞特性，是腫瘤發(fā)生維持、轉移、復發(fā)的重要因素。

miRNA是一類內(nèi)源性單鏈小片段非編碼RNA分子，在基因表達調(diào)控中起著非常重要的作用[4]。目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA在腫瘤中起著癌基因和抑癌基因的作用，對腫瘤細胞分化和凋亡等過程具有重要的調(diào)節(jié)功能[5]；對腫瘤干細胞相關miRNA的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過多重調(diào)控靶基因來調(diào)節(jié)腫瘤干細胞的自我更新和多向分化[6]。

基于目前對腫瘤干細胞的研究結果，我們推測在肺癌干細胞中可能存在某些特異miRNA對調(diào)節(jié)腫瘤干細胞的生命活動起著重要作用。因此我們利用高通量基因芯片技術，檢測肺癌A549細胞株中SP和non-SP的miRNA表達譜，篩選出差異miRNA，為進一步研究這些miRNA在肺癌干細胞中的功能打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌A549細胞系購于上海麥莎生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶為GIBCO公司產(chǎn)品；Hoechst 33342、verapamil、碘化丙啶購于美國Sigma公司；Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品，miRNA芯片由美國LC Sciences公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) A549細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37 °C、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)；0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶的1:1混合液消化、傳代。實驗采用對數(shù)生長期細胞。

1.2.2 細胞分選 利用BD FACS VantageSE流式細胞儀分選A549細胞系SP及non-SP細胞。收集對數(shù)生長期細胞，制備成單細胞懸液，1 200 r/min離心5 min， PBS洗滌2次，用預熱37 °C的含10%胎牛血清的Hanks’鹽平衡液重懸，調(diào)整細胞數(shù)至1×106/mL。一組加入Hoechst 33342至終濃度為5 mg/L，另一組同時加入verapamil至終濃度為50 μmol/L，37 °C水浴90 min，每隔15 min搖勻一次，孵育結束后，1 200 r/min離心5 min，棄上清，用預冷的含2%小牛血清的PBS洗1次，重懸于含10%胎牛血清的Hanks’鹽平衡液中，加入PI至終濃度為2 mg/L，上流式細胞儀檢測、分選細胞。Hoechst 33342的激發(fā)光為352 nm紫外光，424/44帶通收集藍光，630/22帶通收集紅光。P1的激發(fā)光為488 nm藍光，用575/26帶通收集紅光。

1.2.3 總RNA提取及miRNA芯片分析 Trizol法提取組織中的總RNA，通過異丙醇沉淀法濃縮RNA，用分光光度計定量，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢總RNA質(zhì)量。所用芯片由美國LC Sciences公司制作。通過YM-100（Milllpore）微離心過濾柱得到片段＜300 nt的小RNA。Poly（A）聚合酶在分離到的小RNA 3’端加上Poly（A）尾，再將一個寡聚核苷酸標記與該Poly（A）尾巴連接用于后續(xù)的熒光標記。雙樣品實驗中，用兩個不同的標記物來標記兩個RNA樣品。雜交反應通過微循環(huán)泵雜交儀器在μParafloTM微流體芯片上過夜，雜交使用含有25%的甲酰胺的100 μL 6×SSPE緩沖液，雜交溫度34oC，雜交檢測使用Cy3和Cy5特異性熒光標記。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用激光掃描儀采集雜交圖像，Array-Pro軟件對雜交圖像進行數(shù)字化轉換。數(shù)據(jù)處理和分析首先扣除背景，計算重復點平均值和標準偏差，然后通過LOWESS過濾進行標準化。本實驗為雙色標記實驗，計算兩種檢測信號的比值（log2）和t檢驗的P值，以P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 A549細胞SP檢測及分選結果 運用Hoechst染色法通過流式細胞儀檢測到A549細胞株中存在約1.1%的SP細胞，該部分側群細胞在加入ABCG2通道抑制劑verapamil后比例下降至0.2%（圖1）。

2.2 總RNA提取結果 Trizol一步法提取SP與non-SP細胞總RNA，通過異丙醇沉淀法濃縮RNA，用分光光度計定量。根據(jù)RNA在A260/A280值1.80-2.10之間以及甲醛變性凝膠電泳28S、18S RNA條帶比值≥1.5，鑒定RNA純度及其完整性（圖2）。

2.3 miRNA芯片數(shù)據(jù)分析結果 芯片結果見圖3所示，其中，A：non-SP-Cy3信號強度圖，B：SP-Cy5信號強度圖，C：Cy3/Cy5信號比值圖。當Cy3信號高于Cy5信號時，色彩顯示為綠色；當Cy3與Cy5信號相當時，色彩顯示為黃色；當Cy5信號高于Cy3信號時，色彩顯示為紅色（圖3）。結果顯示，在SP與non-SP細胞中， miRNA表達存在顯著差異。與non-SP相比，在SP細胞中上調(diào)2倍以上的miRNA有9條，下調(diào)2倍以上的miRNA有25條（表1，表2）。

3 討論

腫瘤干細胞學說的提出為腫瘤研究提供了一個新的視角，目前在腫瘤干細胞研究方面已經(jīng)取得了很多令人振奮的結果。運用腫瘤干細胞理論可以比較好地解釋目前臨床上所遇到的腫瘤放化療耐受及腫瘤轉移復發(fā)的困惑。為了進一步研究腫瘤干細胞與一般腫瘤細胞的差異，我們從miRNA——這一新發(fā)現(xiàn)的重要基因調(diào)控分子出發(fā)，利用高通量基因芯片技術檢測兩者之間的miRNA表達譜差異，希望找到腫瘤干細胞相關性miRNA。

圖 1 A549經(jīng)verapamil處理后SP比例由1.1%（A）降為0.2%（B）Fig 1 A549 cells contained 1.1% of SP cells (A), dropped to 0.2% after treatment with the selective ABC transporter inhibitor verapamil (B)

圖 2 SP與non-SP總RNA凝膠電泳Fig 2 Total RNA isolated from SP cells and non-SP cells by gel electrophoresis

圖 3 SP/non-SP miRNA芯片圖譜。圖像以偽色顯示擴大可視的動態(tài)范圍。在Cy3和Cy5的信號強度圖像中，隨著信號強度從1增加到 65 535，對應的色彩會從藍-綠-黃-紅進行漸進變化。在Cy3/Cy5信號比值圖中，當Cy3信號高于Cy5信號時，色彩顯示為綠色；當Cy3信號與Cy5信號相當時，色彩顯示為黃色；當Cy5信號高于Cy3信號時，色彩顯示為紅色。Fig 3 SP/non-SP miRNA chips images. The images are displayed in pseudo colors so as to expand the visual dynamic range. In the Cy3 and Cy5 intensity images, as the signal intensity increases from 1 to 65 535 the corresponding color changes from blue to green, then to yellow, and finally to red. In the Cy3/Cy5 ratio image, when Cy3 level is higher than Cy5 level the color is green; when Cy3 level is equal to Cy5 level the color is yellow;and when Cy5 level is higher than Cy3 level the color is red.

Northern blot分析和克隆技術均可用于miRNAs表達分析，但二者都存在著工作量大、敏感性較低的缺點，無法用于高通量的miRNAs表達譜分析。而微陣列技術可以一次性同時檢測數(shù)百個miRNA的表達。miRNA寡核苷酸芯片是目前研究腫瘤特異性miRNA表達的最常用的高通量方法。

本研究所使用基因芯片及其質(zhì)控探針由美國LC Sciences（聯(lián)川）公司提供，采用μParafloTMmicroRNA（miRHuman 13.0版）微陣列芯片技術平臺，涵蓋了Sanger miR-Base序列數(shù)據(jù)庫中所有物種。每張芯片上的檢測探針在雜交反應中均進行了至少3個重復。

根據(jù)芯片結果我們發(fā)現(xiàn)，肺癌SP細胞和non-SP細胞miRNA表達譜存在巨大差異：差異達2倍以上的miRNA共計34條，其中9條表達上調(diào)，25條表達下調(diào)。上調(diào)最顯著（≥4倍）的miRNA為hsa-miR-548m、hsa-miR-498、hsa-miR-1281、hsa-miR-940，共計4條。下調(diào)最顯著（≥4倍）的miRNA有hsa-miR-98、hsa-miR-31*、hsa-miR-16-2*、hsa-miR-15b*、hsa-let-7e、hsa-miR-26b、hsa-let-7c、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-20b，共計9條?？梢娫赟P中，明顯下調(diào)的miRNAs基因在數(shù)量上超過了在SP中明顯上調(diào)的miRNA基因。

表 1 上調(diào)2倍以上的miRNAsTab 1 Over-expression miRNAs (fold changes≥2)

表 2 下調(diào)2倍以上的miRNAsTab 2 Low-expression miRNAs (fold changes≥2)

從圖3基因芯片圖譜信號強度對比我們可以看出，SP細胞中miRNA表達豐度要遠低于non-SP細胞，這與國外文獻[7]報道干細胞的miRNA表達水平隨著細胞的分化而逐漸增高相符。特別是let-7家族，Shell等[8]認為let-7表達水平可以反映腫瘤的分化和惡性程度：let-7表達水平越低表明細胞越原始，癌性越顯著。我們通過本次芯片篩查發(fā)現(xiàn)在SP細胞中l(wèi)et-7家族成員也顯著缺失，這可能與SP細胞高致瘤性、高轉移潛力和更高的耐藥性相關，需要進一步研究證實。在乳腺癌中，宋爾衛(wèi)等[9]發(fā)現(xiàn)let-7家族成員在乳腺癌干細胞中表達下降或缺失最明顯；進一步對let-7的功能研究表明，let-7通過抑制Ras癌基因和促進HMGA2基因表達，負調(diào)節(jié)乳腺癌干細胞的“干性”與成瘤性。let-7高表達的乳腺癌HMGA2蛋白表達增高，引起腫瘤細胞分化，使腫瘤轉移潛能下降；而let-7的缺失使乳腺癌干細胞RAS癌基因高表達，維持了乳腺癌干細胞的“干性”。在肺癌中，let-7可能也發(fā)揮了相似的功能，但需要相關研究證實。

在SP中下調(diào)的hsa-miR-31*、hsamiR-16-2*、hsa-miR-15b*、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-29b、hsa-miR-29c均屬于抑癌功能miRNA，在它們調(diào)控的眾多靶基因中，有些是重要的癌基因，例如RhoA是hsa-miR-31靶基因之一[10]，具有促進腫瘤轉移作用；hsa-miR-15和hsa-miR-16調(diào)控Bcl-2[11]，hsa-miR-29調(diào)控Mcl-1[12]，這兩個都是抗凋亡基因；hsa-miR-125靶基因之一是ErbB2[13]，是一種促進細胞增殖的原癌基因。這些抑癌miRNA在SP中的缺失或低表達會導致對應癌基因高表達，可能在維持肺癌干細胞耐藥、抗凋亡、高轉移潛力等多種特性中具有重要作用，值得進一步進行研究。

由于本次芯片采用的數(shù)據(jù)庫是目前最新的13.0版本，因此很多具有差異的miRNA在以往均無相關研究報道，特別是在SP中上調(diào)的hsa-miR-548m、hsamiR-498、hsa-miR-1281、hsa-miR-940、hsa-miR-1274b、hsa-miR-1274a等均尚無與肺癌有關的研究，這些上調(diào)的miRNA到底在SP細胞中起到何種作用，還需要進一步深入研究。

本研究利用miRNA芯片技術，篩選出肺癌A549細胞株中SP與non-SP細胞差異表達的miRNA，為進一步研究miRNA在肺癌干細胞中的功能及表達調(diào)控模式提供了基礎。對篩選出的差異miRNA進行驗證和功能學的研究將是下一步應開展的工作，通過對miRNA功能及表達調(diào)控模式的研究，將對肺癌的預防、診斷和治療理念提供新的思路和有效途徑。