徐慧慧 齊艷麗 頓嵩 高英 邱雪杉

BMPs是TGF-beta家族成員之一，除了在骨和軟骨的發(fā)育及誘導(dǎo)異位骨和軟骨發(fā)生的過程中具有重要作用外，它們還具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)作用[1,2]。BMP家族受體分為I型和II型，I型受體包括BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A，II型受體包括ACVRIIA、ACVRIIB、BMPR2[2]。其中I型受體決定了信號(hào)傳遞的特異性[3-5]。近年來很多研究[9-19]表明BMP7具有抑制和促進(jìn)多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的雙重作用。但是，BMP7對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響及其究竟是通過分別激活哪幾種I型受體抑制和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖目前尚未明確。本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)了BMP7對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響，隨后通過在肺癌細(xì)胞系中阻斷不同的I型受體，觀察其對(duì)BMP7處理后細(xì)胞增殖作用的影響，初步探討不同的I型受體在BMP7信號(hào)傳導(dǎo)過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司；重組人BMP7細(xì)胞因子購(gòu)自R&D公司（克隆號(hào)：354-BP）；鼠單克隆抗人BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司（克隆號(hào)：sc-73750；sc-73751；sc-73676）；RT-PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司；MTT購(gòu)自Amresco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肺腺癌細(xì)胞A549在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中貼壁生長(zhǎng)；人支氣管上皮細(xì)胞HBE在含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中貼壁生長(zhǎng)；NCI-H460、SPC-A-1、LTEP-a-2在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中貼壁生長(zhǎng)，均在37oC、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）提取細(xì)胞總RNA 按RT-PCR（TaKaRa）試劑盒方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，取2 μL的RT產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，BMP7引物F：5’-GGT CAT GAG CTT CGT CGT CAA CC-3’，R：5’-GCA GGA AGA GAT CCG ATT CC-3’，片段長(zhǎng)度：235 bp，退火溫度為58oC；BMPR1A引物F：5’-TGA TTT GGA ACA GGA TGA AGC-3’，R：5’-TGT AGT ACA TTT CAG GAA GTC-3’，片段長(zhǎng)度：382 bp，退火溫度為56oC；BMPR1B引物F：5’-GAC ACT CCC ATT CCT CAT C-3’，R：5’-GCT ATA GTC CTT TGG ATC AG-3’，片段長(zhǎng)度：355 bp，退火溫度為55oC；ACVR1A引物F：5’-GCA TTC CCA GAG CAC CAA TC-3’，R：5’-CTG TGA GTC TTG CGG ATG GA-3’，片段長(zhǎng)度：383 bp，退火溫度為59oC；β-actin引物F：5’-AAA TCG TGC GTG ACA TTA A-3’，R：5’-CTC GTC ATA CTC CTG CTT G-3’，片段長(zhǎng)度：513 bp，退火溫度為55oC。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 以1×103/孔的細(xì)胞密度，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入BMP7（100 ng/mL，對(duì)照組加入等體積PBS。每過24 h每組各取6孔細(xì)胞檢測(cè)增殖情況。每孔內(nèi)加入20 mL MTT溶液，37oC孵育4 h后，吸取培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。

1.5 抗體阻斷實(shí)驗(yàn) 以1×103/孔的細(xì)胞密度，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，將細(xì)胞分成6組，分別為：對(duì)照組；BMP7處理組；BMP7+BMPR1A處理組；BMP7+BMPR1B處理組；BMP7+ACVR1A處理組；BMP7+BMPR1A+BMPR1B處理組。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞在10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液、37oC培養(yǎng)箱培養(yǎng)至貼壁，吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞2次，向BMP7+BMPR1A處理組、BMP7+BMPR1B處理組、BMP7+ACVR1A處理組、BMP7+BMPR1A+BMPR1B處理組分別加入經(jīng)PBS稀釋的（濃度為100 ng/mL）鼠抗人單克隆抗體BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A、BMPR1A+BMPR1B，每孔1 mL。對(duì)照組與BMP7處理組分別每孔加入等量的PBS。抗體加入1 h后吸除，PBS洗滌2次，向各處理組中每孔加入含外源性BMP7（濃度為100 ng/mL）的上述1640培養(yǎng)液，對(duì)照組加入等量的上述1640培養(yǎng)液。每隔24 h每組各取6孔采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。連續(xù)檢測(cè)至第96 h。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A在4種NSCLC細(xì)胞系和HBE細(xì)胞系中的表達(dá)情況 應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)4種NSCLC細(xì)胞系和HBE細(xì)胞系中不同的I型受體mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示I型受體的表達(dá)具有細(xì)胞系特異性。其中，在NCI-H460細(xì)胞系中三種I型受體均有表達(dá)，在A549、LTEP-a-2細(xì)胞系中BMPR1A、BMPR1B兩種I型受體同時(shí)表達(dá)，在HBE中僅BMPR1A一種受體表達(dá)，而在SPC-A-1中則三種受體幾乎均無表達(dá)（圖1）。

2.2 外源性BMP7對(duì)肺大細(xì)胞癌NCI-H460細(xì)胞增殖的影響 通過上述的實(shí)驗(yàn)，我們篩選出同時(shí)表達(dá)三種I型受體的NCI-H460細(xì)胞作為研究對(duì)象來研究BMP7對(duì)細(xì)胞增殖的影響。首先，我們向常規(guī)培養(yǎng)的NCI-H460細(xì)胞中加入外源性BMP7（20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL）并通過MTT法檢測(cè)培養(yǎng)48 h后細(xì)胞增殖的變化情況（實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次）。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比外源性BMP7具有顯著抑制NCI-H460細(xì)胞增殖的能力（P=0.013, P＜0.001, P＜0.001, P＜0.001），并且其抑制細(xì)胞增殖的能力具有濃度依賴性。其中BMP7濃度＞100 ng/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制最為顯著（圖2）。 隨后，我們又向常規(guī)培養(yǎng)的NCI-H460細(xì)胞中加入外源性BMP7（100 ng/mL）并通過MTT法檢測(cè)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后細(xì)胞增殖的變化情況（每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次），結(jié)果顯示，BMP7抑制細(xì)胞增殖的能力亦具有時(shí)間依賴性（P=0213, P=0.023, P＜0.001, P＜0.001），其中BMP7處理第72 h時(shí)其抑制細(xì)胞增殖的能力最為顯著（圖3）。

圖 1 不同細(xì)胞中BMP I型受體mRNA的表達(dá)情況。A：BMPR1A mRNA在各細(xì)胞系中的表達(dá)情況；B：BMPR1B mRNA在各細(xì)胞系中的表達(dá)情況；C：ACVR1A mRNA在各細(xì)胞系中的表達(dá)情況。Fig 1 The mRNA expression levels of BMP type I receptors. A: Expression of BMPR1A mRNA in cell lines; B: Expression of BMPR1B mRNA in cell lines; C: Expression of ACVR1A mRNA in cell lines.

圖 2 BMP7以濃度依賴方式抑制NCI-H460細(xì)胞的增殖Fig 2 BMP7 inhibit proliferation of NCI-H460 cell in dosedependent manner

圖 3 BMP7以時(shí)間依賴方式抑制NCI-H460細(xì)胞的增殖Fig 3 BMP7 inhibit proliferation of NCI-H460 cell in timedependent manner

圖 4 特異性抗體分別阻斷BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A后BMP7抑制NCI-H460細(xì)胞增殖能力的變化情況Fig 4 The effect of BMP7 treatment on NCI-H460 cell in proliferation after blocking endogenous BMPR1A, BMPR1B and ACVR1A respectively

圖 5 特異性抗體聯(lián)合阻斷BMPR1A、BMPR1B后BMP7抑制NCI-H460細(xì)胞增殖能力的變化情況Fig 5 The effect of BMP7 treatment on NCI-H460 cell in proliferation after blocking endogenous BMPR1A and BMPR1B

圖 6 不同濃度I型抗體阻斷對(duì)BMP7抑制NCI-H460細(xì)胞增殖能力的影響情況Fig 6 The effect of anti-type I receptors at different concentrations on proliferation of NCI-H460 cell treated by BMP7

2.3 特異性抗體分別阻斷BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A、BMPR1A+BMPR1B后BMP7對(duì)NCI-H460細(xì)胞增殖的影響 為了進(jìn)一步研究BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A在BMP7抑制NCI-H460細(xì)胞增殖中的作用，我們向正常培養(yǎng)的NCI-H460細(xì)胞的培養(yǎng)基中分別加入濃度為100 ng/mL的特異性抗體anti-BMPR1A、anti-BMPR1B、anti-ACVR1A、anti-BMPR1A+anti-BMPR1B阻斷內(nèi)源性I型受體，然后再向細(xì)胞中加入濃度為100 ng/mL的外源性BMP7（詳見抗體阻斷實(shí)驗(yàn)），通過MTT法檢測(cè)96 h內(nèi)細(xì)胞增殖的變化情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組相比anti-BMPR1A、anti-BMPR1B、anti-BMPR1A+anti-BMPR1B阻斷組BMP7對(duì)細(xì)胞增殖的抑制能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003, P=0.014, P＜0.001），其中anti-BMPR1A+anti-BMPR1B阻斷組BMP7對(duì)細(xì)胞增殖的抑制能力幾乎減弱至0。而anti-ACVR1A阻斷組BMP7對(duì)細(xì)胞增殖的抑制能力減弱不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.074）。這說明BMP7主要是通過BMPR1A、BMPR1B兩種I型受體抑制NCI-H460細(xì)胞增殖（圖4，圖5）。本實(shí)驗(yàn)中三種抗體濃度的確定是依據(jù)系列滴度分析實(shí)驗(yàn)，即：將細(xì)胞接種于96孔板中并將其分成對(duì)照組、BMP7處理組、BMP7+anti-BMPR（50 ng/mL）處理組、BMP7+anti-BMPR（100 ng/mL）處理組、BMP7+anti-BMPR（150 ng/mL）處理組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。按照抗體阻斷實(shí)驗(yàn)中的操作方法向各處理組中依次加入相應(yīng)濃度的抗體及100 ng/mL的BMP7，72 h后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表明anti-BMPR1A和anti-BMPR1B對(duì)BMP7信號(hào)的阻斷能力具有濃度依賴性，并且它們?cè)跐舛取?00 ng/mL時(shí)的阻斷能力尤為顯著。而anti-ACVR1A對(duì)BMP7信號(hào)的阻斷效果不顯著（圖6）。

3 討論

BMPs是TGF-beta超家族的成員，BMPs最初是從骨髓中被分離出并以其具有成骨作用而被人們所認(rèn)識(shí)[1]。隨著對(duì)BMPs研究的不斷增多，人們發(fā)現(xiàn)BMPs還具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)作用，并在胚胎發(fā)育、器官形成過程中發(fā)揮了重要的作用[2]。BMPs通過與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合而發(fā)揮作用，并且其受體與其它TGF-beta超家族成員分子的受體一樣，分為I型和II型，屬于絲-蘇氨酸激酶受體家族[3]。其中I型受體包括BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A三個(gè)亞型，II型受體包括ACVRIIA、ACVRIIB、BMPR2三個(gè)亞型。BMPs引起的信號(hào)傳遞需要與I型、II型受體形成復(fù)合體形式。BMPs首先與II型受體結(jié)合隨后誘導(dǎo)I型受體發(fā)生磷酸化，激活的I型受體迅速作用于細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的Smads信號(hào)傳遞蛋白，通過Smads蛋白啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，形成有活性的復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[4]。BMPs可以結(jié)合不同的I型受體，表現(xiàn)為信號(hào)傳遞的多樣性，且I型受體決定信號(hào)傳遞的特異性[5]。然而，另有研究證實(shí)BMPs與I型受體的結(jié)合也具有一定的選擇性，例如：BMP7傾向于與ACVR1A優(yōu)先結(jié)合，同時(shí)它與BMPR1A、BMPR1B也有一定的親和力，而BMP2、BMP4傾向于與BMPR1A結(jié)合[6-8]。但是，目前這三種BMP I型受體在BMPs信號(hào)傳遞過程中的具體作用機(jī)制尚不明確。

目前大量的研究發(fā)現(xiàn)BMPs及其受體在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要而復(fù)雜的作用。首先，BMPs及其受體的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，Yang等[9]在小鼠前列腺癌模型中的研究表明：隨著病情的發(fā)展，前列腺中的BMP7表達(dá)量逐漸增加。而BMPR1A、BMPR1B的表達(dá)逐漸減少甚至消失[10]。Rothhammer等[11]的研究表明BMP7在痣、惡性黑色素瘤原發(fā)灶、惡性黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)量依次增強(qiáng)；BMP4在痣、惡性黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶、惡性黑色素瘤原發(fā)灶中的表達(dá)量依次增強(qiáng)，并且內(nèi)源性BMP4具有促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的作用；BMP7在惡性黑色素瘤中的表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)，BMP7表達(dá)可以作為惡性黑色素瘤進(jìn)展的一個(gè)新的診斷指標(biāo)[12]。Alarmo等[13]對(duì)大量乳腺腫瘤細(xì)胞系、乳腺癌組織、正常乳腺組織進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)，分析了BMP2-BMP8及其各種受體的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞系中BMP4、BMP7的表達(dá)明顯上調(diào)而BMPR（除外BMPR1B）的表達(dá)無顯著差異。值得注意的是，BMPR1B在正常乳腺組織中無表達(dá)，而在大部分乳腺癌高表達(dá)，并且ER陽(yáng)性乳腺癌中BMPR1B的表達(dá)與腫瘤的高分級(jí)、高增殖能力及不良預(yù)后呈正相關(guān)[13,14]。其次，BMPs在腫瘤中發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)具有組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)特異性。例如：BMP2在胰腺癌細(xì)胞中具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用[15,16]，而它在乳腺癌、前列腺癌LNCaP細(xì)胞、胃MKN74細(xì)胞以及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中卻具有抑制增殖的作用[17-19]。另外，BMP7在前列腺BPH-1上皮細(xì)胞中具有抑制細(xì)胞增殖的作用，而在前列腺癌PC-3細(xì)胞、C4-2B細(xì)胞中卻分別具有促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移和抑制由血清饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用[19]。綜上所述，BMPs具有促進(jìn)和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的雙重作用。然而，BMPs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中如此復(fù)雜的生物學(xué)作用是否與BMPs分別與不同的I型受體結(jié)合后產(chǎn)生不同的生物學(xué)作用有關(guān)，目前仍未見報(bào)道，BMPs對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖有何影響目前亦未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)基于BMP7能夠與三種I型受體結(jié)合的理論基礎(chǔ)，篩選出了三種I型受體均有表達(dá)的肺大細(xì)胞癌NCI-H460細(xì)胞作為研究對(duì)象，首先研究了BMP7對(duì)NCI-H460細(xì)胞增殖的作用，然后通過分別阻斷三種I型受體，研究了BMP7與不同的I型受體結(jié)合后對(duì)NCI-H460細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明BMP7通過同時(shí)激活BMPR1A、BMPR1B共同抑制NCI-H460細(xì)胞的增殖。而ACVR1A在BMP7信號(hào)傳導(dǎo)過程中對(duì)NCI-H460細(xì)胞增殖的影響不明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為在前列腺癌中BMPR1A、 BMPR1B表達(dá)下調(diào)提供了理論依據(jù)。值得注意的是，盡管BMPR1A、BMPR1B在BMP7信號(hào)傳導(dǎo)過程中均具有抑制NCI-H460細(xì)胞增殖的作用，但是他們很有可能通過激活不同的信號(hào)通路共同發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。

由于本實(shí)驗(yàn)涉及的細(xì)胞系非常局限，也未探討B(tài)MP7及其I型受體對(duì)肺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡等生物學(xué)作用的影響，亦未排除ACVR1A在蛋白水平無表達(dá)或者即使表達(dá)也無被BMP7激活的可能性，因此還不能解釋ACVR1A在BMP7信號(hào)傳遞過程中所發(fā)揮的作用。本實(shí)驗(yàn)僅為今后進(jìn)一步研究BMP7在腫瘤中的作用機(jī)制奠定了部分基礎(chǔ)，也為臨床治療提供了新的可能靶點(diǎn)。