楊立平 鄧桂明 歐陽(yáng)榮

烏藥為樟科植物烏藥 Lindera strychnifolia(Sieb．ef Zucc．)Vill．的干燥塊根［1］，烏藥中主要含有揮發(fā)油、異喹啉類生物堿及呋喃倍半萜三類主要成分［2］，共同構(gòu)成了烏藥的化學(xué)特征。烏藥為歷代中醫(yī)臨床常用的理氣藥，功能理氣止痛、溫腎散寒［3］。

烏藥的現(xiàn)代研究多注重于生藥的化學(xué)成分及藥理作用的研究，對(duì)于產(chǎn)地加工、干燥工藝對(duì)成分的影響，尚無(wú)系統(tǒng)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)手段，對(duì)烏藥的產(chǎn)地加工工藝進(jìn)行研究，通過(guò)比較不同溫度、攤層厚度、干燥時(shí)間等與干燥工藝直接相關(guān)的因素，采用烏藥主要有效成份烏藥醚內(nèi)酯為指標(biāo)［4］，得出了烏藥產(chǎn)地加工工藝的規(guī)范化工藝參數(shù)。該研究方法新穎，手段先進(jìn)，為烏藥炮制的規(guī)范化研究提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent110高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);不銹鋼電熱恒溫水浴鍋(北京市醫(yī)療設(shè)備廠);KQ-600型超聲波清洗器(昆山市淀山湖檢測(cè)儀器廠);植物粉碎機(jī)(泰特儀器有限公司);水分測(cè)定裝置。

甲醇、乙腈為色譜純(天津市密歐化學(xué)試劑有限公司);甲苯、無(wú)水乙醇、香草醛、石油醚、乙酸乙酯、硫酸等為分析純;水(滅菌用水，自制)。

烏藥藥材，采于湖南衡東，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥檢室鑒定為樟科植物烏藥Lindera strychnifolia(Sieb．ef Zucc．)Vill．的干燥塊根。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 產(chǎn)地新鮮藥材切制工藝的考察

2.1.1 烏藥飲片含水量曲線的制備

2.1.1.1 樣品的制備 藥材凈取后直接切片，以3 kg/m2(約1 cm厚)、6 kg/m2(約2 cm厚)、9 kg/m2(約3 cm厚)的厚度攤層，分別在60℃、80℃、100℃溫度下，烘箱中干燥，每1 h取樣一次。從所取樣品中稱取10 g，粗粉碎后按2005年版《中國(guó)藥典》附錄中之甲苯法測(cè)飲片含水量。(見表1)。

表1 不同溫度及攤層厚度下烏藥含水量測(cè)定

2.1.1.2 結(jié)果分析 結(jié)果表明:烏藥在常壓下80℃、100℃時(shí)3 kg/m2、6 kg/m2組在3 h后含水量均趨于穩(wěn)定，而9 kg/m2組趨于恒定的時(shí)間各不相同。

2.1.2 烏藥醚內(nèi)酯的含量測(cè)定

2.1.2.1 色譜條件 流動(dòng)相:梯度洗脫(甲醇:乙腈:水)梯度洗脫，洗脫梯度見表2;波長(zhǎng)235 nm;柱溫:35℃;流速:1 ml/min。

表2 梯度洗脫表

2.1.2 對(duì)照品的制備 精密稱定烏藥醚內(nèi)酯對(duì)照品2 mg，置25 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。(每1 ml中含烏藥醚內(nèi)酯80 μg)。

2.1.3 樣品制備

2.1.3.1 浸泡時(shí)間的考察 烏藥粉碎成細(xì)粉，取1 g，每個(gè)供試品取8份，分別精密稱定，置250 ml錐形瓶中，參照《中國(guó)藥典》2005年版一部烏藥含量測(cè)定項(xiàng)下所用溶劑，各精密加入甲醇 50 ml，稱重重量，分別浸泡 0 h、1 h、4 h、24 h 后，超聲15 min，放冷，再稱定重量，并用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，備用。結(jié)果表明烏藥浸泡0 h和1 h時(shí)烏藥醚內(nèi)酯的含量比較高，但兩者的含量相差不大，而4 h、24 h含量降低，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇將藥材粉末浸泡0 h后進(jìn)行提取。

2.1.3.2 超聲時(shí)間的考察 烏藥粉碎成細(xì)粉，取1 g，每個(gè)供試品取10份，分別精密稱定，置250 ml錐形瓶中，參照《中國(guó)藥典》2005年版一部烏藥含量測(cè)定項(xiàng)下所用溶劑，各精密加入甲醇50 ml，稱重重量，分別振搖10 min、超聲15 min、30 min、60 min、90 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，備用。結(jié)果表明，超聲提取比手動(dòng)振搖的效果好，且超聲15 min效果最好。

2.1.3.3 提取方法的考察 烏藥粉碎成細(xì)粉，取1 g，每個(gè)供試品取4份，分別精密稱定，置250 ml錐形瓶中，參照《中國(guó)藥典》2005年版一部烏藥含量測(cè)定項(xiàng)下所用溶劑，加甲醇50 ml，稱重，一份超聲 15 min，放冷，再稱定重量，用 0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液備用。另一份用索氏提取器在60℃提取4 h，所得固體用甲醇定容至10 ml容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液備用。結(jié)果表明，用超聲提取15 min比用索氏提取器提取效果更好。

2.1.3.4 提取次數(shù)的考察 烏藥粉碎成細(xì)粉，取1 g，每個(gè)供試品取4份，分別精密稱定，置250 ml錐形瓶中，參照《中國(guó)藥典》2005年版一部烏藥含量測(cè)定項(xiàng)下所用溶劑，加甲醇50 ml，稱重，第1份超聲提取一次，超聲15 min，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液備用。第2份超聲提取二次，分別15 min，第3超聲提取三次，其他操作同上。結(jié)果表明，超聲提取次數(shù)對(duì)烏藥醚內(nèi)酯的含量影響不大，為節(jié)約時(shí)間，故超聲提取一次。

2.1.3.5 樣品提取方法 取本品細(xì)粉約1 g，精密稱定，置250 ml錐形瓶中，超聲提取二次，每次加甲醇25 ml，超聲15 min，合并濾液至50 ml量瓶中，并加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，備用。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取各濃度的烏藥醚內(nèi)酯對(duì)照品溶液10 μl，其濃度分別為 0.016 mg/ml、0.032 mg/ml、0.048 mg/ml、0.060 mg/ml、0.080 mg/ml、0.160 mg/ml注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積值Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程:Y=3469.84575X-2.73808，r=0.9997。結(jié)果表明，烏藥醚內(nèi)酯在0.16 μg/ml～1.6 μg范圍內(nèi)峰有較好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次。其烏藥醚內(nèi)酯峰面積的RSD為1.34%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取當(dāng)日配置的供試品溶液，于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h 分別進(jìn)樣 10 μl，測(cè)定樣品中烏藥醚內(nèi)酯峰面積的RSD值為3.36%。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品，按3.1.3項(xiàng)下方法，分別制備供試液6份，每份進(jìn)樣10 μl，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果RSD=1.31%。

2.1.8 加樣回收率 稱取已知含量的供試品(含12.00%的水分，含量1.3718 mg/g)約0.33 g6份，精密稱定，分別置50 ml容量瓶中，分別精密加入0.1000 mg/ml烏藥醚內(nèi)酯對(duì)照品溶液5 ml，用甲醇稀釋至刻度。按2.1.3項(xiàng)下操作，分別制得供試液，以上述色譜條件測(cè)定烏藥醚內(nèi)酯的含量，烏藥醚內(nèi)酯的平均回收率為103.7%，RSD為1.49%。(見表3)。

2.1.9 樣品的測(cè)定 取供試品，按2.1.3項(xiàng)下的操作，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。

表3 加樣回收率試驗(yàn)(n=6)

表4 不同溫度及攤層厚度下烏藥醚內(nèi)酯的測(cè)定(g，%)

2.2 干燥藥材切制工藝的考察

2.2.1 浸潤(rùn)方法的考察 將烏藥干燥藥材取四份，分別進(jìn)行減壓潤(rùn)、減壓泡、常壓潤(rùn)、常壓泡的過(guò)程后進(jìn)行切片，按上述樣品制備方法制備供試品溶液，測(cè)得烏藥醚內(nèi)酯含量分別為 0.128 mg/g、0.148 mg/g、0.176 mg/g 和 0.148 mg/g。

2.2.2 結(jié)果分析 干燥后的烏藥在常壓下潤(rùn)濕后切片的加工方法所測(cè)得的烏藥醚內(nèi)酯含量比常壓浸泡和減壓條件下潤(rùn)濕，浸泡后切片的加工方法所測(cè)得的烏藥醚內(nèi)酯含量高。

3 討論

3.1 干燥對(duì)含揮發(fā)性成分的藥材的質(zhì)量影響比較大。而現(xiàn)代對(duì)中藥材干燥工藝的研究很少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定不同干燥溫度、干燥時(shí)間下烏藥醚內(nèi)酯的含量，結(jié)果表明，溫度對(duì)烏藥醚內(nèi)酯的含量影響較大。

3.2 通過(guò)上述試驗(yàn)結(jié)果表明烏藥因其產(chǎn)地加工不同有效成分存在差異，采收后的烏藥直接加工所含有的烏藥醚內(nèi)酯含量比較高。

3.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)湖南烏藥細(xì)根部位和根部的非藥用部位分別進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)烏藥除根莖部位外細(xì)根與其根部的非藥用部位所測(cè)得的烏藥醚內(nèi)酯含量也符合藥典規(guī)定。

3.4 本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行浸泡時(shí)間考察時(shí)，烏藥浸泡0 h和1 h時(shí)烏藥醚內(nèi)酯的含量比較高，但兩者的含量相差不大，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇將藥材粉末浸泡0 h后進(jìn)行提取。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典．化學(xué)工業(yè)出版社，2005:58．

［2］杜志謙，夏華玲，江海肖．烏藥揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析．中草藥，2003，34(4):308．

［3］王軍偉，阮冰．烏藥的植化及藥理研究概況．浙江中醫(yī)雜志，2006，11(41):675．

［4］程顯隆，魏鋒，馮玉飛，等．RP-HPLC法測(cè)定烏藥中烏藥醚內(nèi)酯和烏藥內(nèi)酯的含量．藥物分析雜志，2003，23(3):225．