周春奎, 胡雪峰, 趙 騰, 常 明, 張海寧

有報(bào)道稱[1],對(duì)大鼠進(jìn)行小劑量 3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid,3-NPA)預(yù)處理不但不會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)組織學(xué)損傷,反而對(duì)再次發(fā)生的局灶性腦缺血產(chǎn)生耐受性,此現(xiàn)象的機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。目前,在蛋白質(zhì)組學(xué)水平研究 3-NPA對(duì)腦缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)的保護(hù)機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用 Zea Longa的大腦中動(dòng)脈線栓法并加以改進(jìn),建立局灶性腦缺血-再灌注模型,以小劑量 3-NPA對(duì)預(yù)處理組大鼠進(jìn)行干預(yù),應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合質(zhì)譜鑒定找出預(yù)處理組與對(duì)照組差異表達(dá)的神經(jīng)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白,通過(guò)對(duì)存在差異的神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白進(jìn)行功能分析,為進(jìn)一步探討 3-NPA預(yù)處理在 IRI后產(chǎn)生的腦保護(hù)作用提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料 CyDye花青素?zé)晒馊玖?Cy2,Cy3,Cy5)、24cm固相 pH梯度干膠條(Immobilized pH gradient,IPG,pH 4～ 7)、CHAPS、兩性電解質(zhì) (pharmalyte,p H 3～10)、二硫蘇糖醇 (DTT)、碘乙酰胺(IAA)、尿素、丙烯酰胺、甘氨酸、Tris、SDS、Clean-up試劑盒購(gòu)自 GE Healthcare-Amersham Biosciences(Uppsala,Sweden);L-谷氨酰胺和 3-NPA購(gòu)自 Sigma Aldrich(Saint Louis,USA)。

1.2 儀器 IPGphor II等電聚焦儀、DALTSix電泳系統(tǒng)、Typhoo9400系列多功能激光掃描成像系統(tǒng)、DeCyder差異分析軟件和 MALDI-TOF質(zhì)譜均為GE Healthcare-Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物及分組 雄性 Wistar大鼠 20只,體重 250～300g,由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供及飼養(yǎng)。隨機(jī)分組:(1)生理鹽水 +缺血再灌注組(對(duì)照組);(2)3-NPA預(yù)處理 +缺血再灌注組(預(yù)處理組)。3-NPA濃度為 4mg/ml,實(shí)驗(yàn)前用雙蒸水新鮮配制,用 NaOH調(diào)節(jié) pH至 7.4。預(yù)處理組大鼠腹腔注射 3-NPA(20mg/kg),對(duì)照組腹腔注射等體積生理鹽水,于 72h后分別制作腦缺血-再灌注模型。

1.4 大腦中動(dòng)脈缺血-再灌注模型制備 采用Zea Longa的大腦中動(dòng)脈線栓法(MCAO)并加以改進(jìn),建立局灶性腦缺血-再灌注模型,大鼠術(shù)后 2h完全清醒、神經(jīng)功能障礙評(píng)分達(dá) 3分、且再灌注 72h后未死亡的動(dòng)物納入實(shí)驗(yàn)。

1.5 蛋白質(zhì)樣品的制備 大鼠術(shù)后分別于72h腹腔內(nèi)注射 10%水合氯醛麻醉,快速斷頭處死,冰上剝離左側(cè)大腦,用預(yù)冷超純水沖洗腦組織中殘留血液,取梗死病灶側(cè)大腦皮層約 100mg(濕重),放入研缽內(nèi),加入提取裂解液 500μl,同時(shí)加入 1%核酸酶和 1%蛋白酶抑制劑,混勻,冰浴研磨勻漿,研磨時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。室溫變性作用 60min,然后15℃,25000r/min離心 30min,收集上清液。蛋白樣品參照 2D Clean-up試劑盒說(shuō)明書去除雜質(zhì)。用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)樣品濃度。

1.6 CyDye熒光染料標(biāo)記蛋白質(zhì)樣品 將各樣品 pH值調(diào)至 8.5,每份樣本 50μg避光條件下加入 1μl(400pmol/L)的 CyDye(Cy3、Cy5、Cy2)熒光工作液,其中 Cy2標(biāo)記 20個(gè)樣本各 25μg組成的混合物作為內(nèi)標(biāo),具體標(biāo)記情況如表1所示。參照 Skynner法避光冰浴 30min后,加入 1μl 10mmol/L賴氨酸終止反應(yīng)。

表1 DIGE膠內(nèi)樣品分組及組成

1.7 熒光差異雙向凝膠(DIGE)電泳制備 分別混合標(biāo)記后的 3塊膠樣品及內(nèi)標(biāo),用重泡漲液(7mmol/L尿素,2mmol/L硫脲,4%CHAPS,1%IPG buffer,40mmol/LDTT,痕量溴酚藍(lán))定容至 450μl。在 20℃,用 IPGphorⅡ等電聚集儀,將 24cm IPG膠條水化重泡漲 6h,按表2所示參數(shù)進(jìn)行等電聚集電泳。等電聚焦(參數(shù)見(jiàn)表2)后,將膠條分別放置在含 2%DTT和 4%IAA的平衡液中各振蕩平衡 15min,再移至 12.5%的 SDS-PAGE膠(24cm×20cm×1.0mm)上端,酸性端旁置蛋白分子量標(biāo)志,20℃在 DALTSix電泳儀中 40mA恒電流電泳,直至溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端。用 Typhoon 9400成像系統(tǒng)掃描雙向電泳凝膠,各熒光染料的激發(fā)光和發(fā)射光波分別為:Cy2,480nm和 530nm;Cy3,540nm和 590nm;Cy5,620nm和 680nm。掃描后的圖像文件用 DeCyder5.0版本軟件分析,應(yīng)用 BVA模式進(jìn)行膠與膠之間匹配,不同組間選擇 Student檢驗(yàn)和單因素方差分析(One-Way ANOVA)。挑選出兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)的顯著增加或者顯著減少的感興趣差異蛋白點(diǎn)。

表2 等電聚焦電泳參數(shù)

1.8 質(zhì)譜分析及蛋白質(zhì)鑒定 取對(duì)照組及預(yù)處理組蛋白樣品各 800μg,按常規(guī)方法進(jìn)行制備膠雙向電泳后,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色,用 Ettan Spot Picker(Amersham Biosciences)機(jī)器人挖取與感興趣差異蛋白相匹配的蛋白點(diǎn)。參照 Wilm方法,對(duì)所挖取的蛋白點(diǎn)用 50%乙腈沖洗,胰蛋白酶消化,以 Ettan Spotter(Amersham Biosciences)在靶條上進(jìn)行樣品點(diǎn)樣后,應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析/電離-飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)肽質(zhì)量指紋譜,并將結(jié)果輸入 NCBI和 Swiss-Prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。

2 結(jié) 果

2.1 DIGE比較各組大鼠腦組織蛋白質(zhì)差異分析 經(jīng) DeCyder-DIAV5.0軟件分析 Cy2、Cy3、Cy5染色的內(nèi)標(biāo)和對(duì)照組及預(yù)處理組的 3塊膠,結(jié)果可見(jiàn)兩組間膠上的蛋白點(diǎn)分布模式基本一致,每塊膠上平均含有 2668個(gè)蛋白點(diǎn),其中可匹配的蛋白點(diǎn) 2080個(gè)。應(yīng)用 DeCyder-BVA軟件分析蛋白質(zhì)表達(dá)量差異,發(fā)現(xiàn) 72h預(yù)處理組與對(duì)照組相比有 52個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量顯著改變(見(jiàn)圖1)。

2.2 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索通過(guò)質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定出3-NPA預(yù)處理組與對(duì)照組之間存在明顯差異的蛋白質(zhì)有 15種,其中神經(jīng)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白 7種,具體如下:ERM家族蛋白(ezrin蛋白、radixin蛋白和 moesin蛋白)、神經(jīng)細(xì)絲蛋白輕鏈多肽(neurofilament light polypeptide,NF-L)、神經(jīng)細(xì)絲蛋白中鏈多肽(neurofilament medium polypeptide,NF-M)、二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白 2(dihydropyrimidinase-related protein 2,DRP-2)、巢蛋白(nestin),以上 7種蛋白預(yù)處理組較對(duì)照組表達(dá)均顯著增高(見(jiàn)表3)。

表3 神經(jīng)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白鑒定結(jié)果

圖1 制備膠圖像顯示差異表達(dá)的蛋白,綠圈內(nèi)為 3-NPA預(yù)處理組與 IRI組的差異表達(dá)點(diǎn)

3 討 論

缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是指各種原因造成局部組織器官缺血,使組織細(xì)胞發(fā)生缺血性損傷,當(dāng)在一定條件下恢復(fù)血液再灌注后,組織細(xì)胞的代謝功能障礙及結(jié)構(gòu)破壞未減輕反而進(jìn)一步加重。IRI往往引起較缺血本身更為嚴(yán)重的損害,導(dǎo)致各種神經(jīng)功能缺損的癥狀,其機(jī)制較多,目前公認(rèn)的有氧自由基、鈣超載、炎癥反應(yīng)等[2]。細(xì)胞骨架蛋白主要功能是維持真核細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu),包括微管、微絲或肌動(dòng)蛋白絲以及中間絲 3種類型。越來(lái)越多的事實(shí)證明,對(duì)細(xì)胞骨架的保護(hù)在腦損傷恢復(fù)中具有重要的意義。細(xì)胞骨架的研究將成為缺氧缺血性腦損傷研究的熱點(diǎn)。

預(yù)適應(yīng)(preconditioning)是指一次或多次短暫、非致命性刺激后,機(jī)體、組織或細(xì)胞能對(duì)其后一段時(shí)間內(nèi)嚴(yán)重、甚至致命性損傷產(chǎn)生一定程度耐受的現(xiàn)象,其機(jī)制包括低氧誘導(dǎo)因子生成、基因表達(dá)的上調(diào)等[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),一些藥物或化學(xué)預(yù)處理可以誘導(dǎo)腦組織產(chǎn)生保護(hù)作用,稱為藥理性預(yù)適應(yīng)。3-NPA是琥珀酸脫氫酶抑制劑,其進(jìn)入機(jī)體后與琥珀酸脫氫酶共價(jià)結(jié)合,抑制線粒體電子傳遞和氧化磷酸化過(guò)程,阻斷呼吸鏈,引起組織缺氧。Wiegand等[1]報(bào)道,小劑量 3-NPA(20mg/kg)預(yù)處理不足以產(chǎn)生神經(jīng)組織學(xué)損傷,反而對(duì)再次發(fā)生的嚴(yán)重局灶性腦缺血缺氧產(chǎn)生耐受性。3-NPA預(yù)處理具有時(shí)間依賴性,預(yù)處理后 3～24h即產(chǎn)生效應(yīng),持續(xù) 1～4d,以預(yù)處理后 3d效應(yīng)最佳。Riepe等[4]發(fā)現(xiàn)在大鼠腹腔注射 3-NPA 20mg/kg預(yù)處理后 1d,腦海馬切片耐受缺血能力明顯提高,神經(jīng)元密度增加約 50%。此外有研究將體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元用 3-NPA預(yù)處理,發(fā)現(xiàn)預(yù)處理后數(shù)小時(shí)至 2d這些神經(jīng)元抗缺氧能力明顯增強(qiáng)。目前認(rèn)為,3-NPA預(yù)處理后可以激活機(jī)體自身內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,提高神經(jīng)元對(duì)缺血缺氧的耐受性,提高腦組織的抗損傷能力。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),鑒定了 3-NPA預(yù)處理組大鼠與IRI組大鼠之間存在差異的蛋白質(zhì) 15種,其中神經(jīng)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白 7種。

3.1 REM蛋白家族 ERM蛋白家族(ezrin/radixin/moesin)是連接皮層細(xì)胞骨架與質(zhì)膜上整合膜蛋白的橋梁分子,其通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜與肌動(dòng)蛋白等細(xì)胞骨架的連接,在細(xì)胞的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、遷移、有絲分裂以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用[5]。在神經(jīng)系統(tǒng)中,ERMs蛋白主要表達(dá)于新皮層的中間帶,這個(gè)區(qū)域密集了遷移的神經(jīng)元和生長(zhǎng)的軸突。在皮層形成過(guò)程中,ERMs是主要的細(xì)胞骨架連接器,在神經(jīng)元遷移和軸突延伸過(guò)程中發(fā)揮重要的功能[6]。有實(shí)驗(yàn)表明,在培養(yǎng)的原代神經(jīng)元細(xì)胞中抑制 ERMs的表達(dá),可抑制生長(zhǎng)錐和神經(jīng)元軸突的形成[7]。由此可知 ERMs在維持神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及促進(jìn)軸突生長(zhǎng)方面具有重要的生物學(xué)作用。

3.2 神經(jīng)細(xì)絲蛋白輕鏈多肽(NF-L)及中鏈多肽(NF-M) 神經(jīng)細(xì)絲蛋白(neurofilament protein,NFP)是神經(jīng)細(xì)胞特異蛋白,屬于中間絲。NFP廣泛的分布在神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、神經(jīng)突起內(nèi)。脊椎動(dòng)物的 NFP是由分子量 70kD(L)、145kD(M)、200kD(H)三種不同的蛋白亞基組成的,神經(jīng)細(xì)絲蛋白輕鏈多肽(neurofilament light polypeptide,NF-L)亞基出現(xiàn)最早并構(gòu)成 NF的核心,神經(jīng)細(xì)絲蛋白中鏈多肽(neurofilament medium polypeptide,NF-M)及神經(jīng)細(xì)絲蛋白重鏈多肽(neurofilament heavy polypeptide,NF-H)亞基通過(guò) NF-L亞基構(gòu)成螺旋狀三聯(lián)體,維持神經(jīng)細(xì)胞骨架的維持。另外,NFP多肽由細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生、通過(guò)順行性慢速軸索流向終末,參與物質(zhì)運(yùn)輸[8]。由此可知,NF-L和 NF-M表達(dá)增高可通過(guò)維持神經(jīng)元細(xì)胞功能及加速軸漿運(yùn)輸,起到神經(jīng)保護(hù)的功能。

3.3 二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白 2(DRP-2) DRP-2參與腦組織的細(xì)胞骨架組成[9],是一種參與神經(jīng)分化與軸突形成的蛋白,與軸突的生長(zhǎng)和可塑性密切相關(guān)。另有研究顯示[10],在卒中后的皮層和紋狀體的缺血半暗帶區(qū)的肥大細(xì)胞中 DRP-2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào),參與缺血時(shí)神經(jīng)元的細(xì)胞防御機(jī)制。目前認(rèn)為,缺血可激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)的潛在的破壞性和保護(hù)性蛋白質(zhì)的合成,而 DRP-2即是一種神經(jīng)系統(tǒng)缺血時(shí)的保護(hù)性蛋白。

3.4 巢蛋白 巢蛋白(nestin)是一種新近發(fā)現(xiàn)的中間絲蛋白,屬于細(xì)胞骨架蛋白,是神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物[11]。這種蛋白在哺乳動(dòng)物胚胎期 CNS的神經(jīng)前體細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá),動(dòng)物出生后其表達(dá)很快降低并消失。但在少數(shù)仍保持神經(jīng)發(fā)生功能的部位(如大腦室管膜下區(qū)、嗅球、海馬齒狀回)仍有表達(dá)。有研究證明,成熟的神經(jīng)元是巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的基礎(chǔ),在損傷后被誘導(dǎo)表達(dá),其中在迷走、喉返神經(jīng)損傷后,疑核中的神經(jīng)元可能有更新的潛力[12]。腦缺血性損傷時(shí),腦室下區(qū)和海馬齒狀回巢蛋白細(xì)胞表達(dá)增加,在缺血中心區(qū)和周邊區(qū)如紋狀體、皮質(zhì)、海馬也出現(xiàn)表達(dá)增高。目前巢蛋白已經(jīng)廣泛用于神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定,巢蛋白的高表達(dá)預(yù)示著神經(jīng)干細(xì)胞的激活。腦缺血時(shí),缺血區(qū)神經(jīng)元壞死或凋亡,激發(fā)非供血區(qū)已成熟神經(jīng)元重返胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞特征并分泌巢蛋白,作為適應(yīng)缺血性腦損傷的一種代償性反應(yīng),或者缺血激活非缺血區(qū)腦實(shí)質(zhì)內(nèi)處于靜息狀態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞,向神經(jīng)元方向分化,遷徙到缺血區(qū)以補(bǔ)充神經(jīng)元的不足。

綜上所述,通過(guò)差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究,根據(jù)各種蛋白的特性,考慮 3-NPA預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能涉及 ERMs蛋白家族、神經(jīng)細(xì)絲蛋白、二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白 2等細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)表達(dá),通過(guò)維持神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及促進(jìn)軸突生長(zhǎng),加速軸漿運(yùn)輸,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞激活并定向分化成神經(jīng)元,最終增加腦組織對(duì)缺血-再灌注的耐受性,起到腦保護(hù)作用。

[1] Wiegand F,Liao W,Bush C,et al.Respiratory chain inhibition induce tolerance to focal cerebral ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,1999,19(11):1229-1237.

[2] 劉啟鋒,劉 明,劉玉河.腦缺血再灌注損傷機(jī)制研究進(jìn)展[J].中華神經(jīng)外科研究雜志,2009,5(6):566-567.

[3] 胡雪峰,周春奎.缺血/低氧預(yù)適應(yīng)的腦保護(hù)作用[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2008,25(1):120-122.

[4] Riepe MW,Ludolph AC.Chemical preconditioning:a cytoprotective strategy[J].Mol Cell Biochem,1997,174(1-2):249-254.

[5] Polesello C,Payre F.Small is beautiful:what flies tell us about ERM Protein function in development[J].Trends Cell Biol,2004,14(6):294-302.

[6] Mintz CD,Dickson TC,Gripp ML,et al.ERMs colocalize transiently with L1 during neocortical axon outgrowth[J].J Comp Neurol J,2003,29,464(4):438-448.

[7] Ramesh V.Merlin and the ERM proteins in Schwann cells,neurons and growth cones[J].Nat RevNeurosci,2004,5(6):462-470.

[8] Wang QS,Hou LY,Zhang CL,et al.Changes of cytoskeletal proteins in nerve tissues and serum of rats treated with 2,5-hexanedione[J].Toxicology,2008,244(2-3):166-178.

[9] Kim HJ,Park HJ,Hong MS,et al.Effect by acupuncture on hypothalamic expression of maternally separated rats:proteomic approach[J].Neurol Res,2010,1(32),1:69-73.

[10] Indraswari F,Wong PT,Yap E,et al.Upregulation of Dpysl 2 and Spna2 gene expression in the rat brain after ischemic stroke[J].Neurochem Int,2009,55(4):235-242.

[11] Yagita Y,Kitagawa K,Sasaki T,et al.Differential expression of Musasil and nestin in the adult rat hippocampus after ischemia[J].Neurosci Res,2002,69:750-756.

[12] Takaoka T,Shiotani A,Saito K,et al.Neuronal re-juvenilization in the nucleus ambiguus after vagal nerve injury[J].Neurosci Res,2009,65(4):353-359.