張向群, 王新平, 景文莉

急性腦缺血后,因缺血灶神經(jīng)細胞死亡而導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損至今仍缺乏真正有效的治療措施和藥物,九十年代初神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn),打破了神經(jīng)元不能再生的傳統(tǒng)觀念,為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)注入了新的活力。但由于神經(jīng)干細胞取材、培養(yǎng)困難,而且有免疫排斥、來源受限、倫理道德的約束限制了其進一步應(yīng)用。而骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells MSCs)具有取材、培養(yǎng)方便,可取自體骨髓進行自體移植,并有多種分化潛能等優(yōu)點,具有良好的臨床應(yīng)用前景。本實驗旨在通過尾靜脈途徑移植 MSCs觀察在大鼠腦缺血再灌注損傷中的治療效果,探討可能的治療機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康成年 SD(Sprague-Dawley)大鼠,體重分別為 140～160g和 260～280g,雄性,由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心(北京)提供。

1.1.2 主要儀器和試劑 5'-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(BrdU,MP Med Biochemicals生產(chǎn));大鼠立體定向儀(西安西北光電儀器制造有限公司制造);鼠抗人尿嘧啶脫氧核苷(Brdu)單克隆抗體(中杉公司);兔抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體(中杉公司);兔抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)多克隆抗體(中杉公司);腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)多克隆抗體(博士德公司);切片機 (MicroM HM325德國);圖像采集 Olympus顯微鏡(北京航空航天大學(xué)圖像采集軟件)

1.2 實驗方法

1.2.1 MSCs的分離和培養(yǎng)及誘導(dǎo) 用斷頸法急性處死 SD大鼠并消毒,無菌條件下取股骨及脛骨。用 MSCs標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,沖出細胞懸液離心,棄上清液,小心疊加到密度為 1.077的 Ficoll-Paque淋巴細胞分離液上層,取單個核細胞層,以 106/cm2密度接種到 75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。隔日全量換液。待原代細胞生長至瓶底的 80%～90%時,用 0.25%胰蛋白酶液和 0.02%EDTA液消化細胞,離心后重新加入標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液懸浮細胞,以 1∶1比例傳代細胞。

1.2.2 MCAO動物模型 用改良 Zea Longa's線栓法阻斷左側(cè)大腦中動脈(MCAO)制成局灶性腦缺血模型,1h后拔線栓再灌注。模型成功的判定:右側(cè)肢體癱瘓,以前肢為重。表現(xiàn)為提尾時大鼠右前肢屈曲,內(nèi)收;或者行走時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒。

1.2.3 神經(jīng)功能缺損評分(NSS) 神經(jīng)功能缺失評分根據(jù) Z.Speise的方法,此評分共 12項,總分 16分,完全正常鼠 =0分,完全功能缺失 =16分,大部分存活鼠梗死后功能評分為 12～14分。

1.2.4 MSCs的移植 制作模型成功后的 7d通過通過尾靜脈注射 1×106Brdu標(biāo)記的 MSCs細胞,對照組不接種。

1.2.5 腦組織石蠟切片制備及免疫組化染色

在不同時間點殺鼠后用 4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液 300ml灌注固定,取腦后置于固定液中 24h以上。常規(guī)石蠟切片以備 HE染色、免疫組織化學(xué)染色。

2 結(jié) 果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞的分離后鏡下的形態(tài)見圖1。

圖1 MSCs呈漩渦狀生長融合 ×40

2.2 尾靜脈組在不同時間點的大鼠頭 MRI成像的比較 可以看到造MCAO模型后尾靜脈移植干細胞后 1d左側(cè)大腦半球大面積的高信號影即梗死灶(見圖2),3m后再次復(fù)查 MRI時沒有高信號影(見圖3),大鼠運動功能恢復(fù)正常。

圖2 尾靜脈組 1d的 MRI

圖3 尾靜脈組 3m的 MRI

表1 不同時間點兩組大鼠神經(jīng)功能評分的影響±s)

表1 不同時間點兩組大鼠神經(jīng)功能評分的影響±s)

與對照組比較*P＜0.05

尾靜脈組對照組P值14.40±0.547714.50±0.54770.4519.50±0.5477*12.33±0.51640.0397.60±0.5345*10.50±0.54770.0165.60±0.5477*8.00±0.63250.0253.60±0.5477*5.50±0.54720.020

2.3 神經(jīng)功能缺損評分 見表1。

2.4 HE染色結(jié)果 對照組可見到明顯梗死灶,缺血區(qū)神經(jīng)細胞明顯減少,可見神經(jīng)細胞變性、壞死,呈胞體皺縮,核固縮、碎裂、溶解,胞漿濃縮紅染,神經(jīng)纖維疏松,間質(zhì)水腫明顯,炎癥細胞浸潤。移植細胞組病理變化較對照兩組輕,神經(jīng)細胞變性、壞死數(shù)量明顯變少,間質(zhì)水腫較輕(見圖4、圖5)。

圖4 對照組的 HE染色(×100)

圖5 移植組的 HE染色(×100)

2.5 免疫組化結(jié)果 (1)BrdU單染結(jié)果:對照組未見到 Brdu免疫組化陽性的細胞著色,尾靜脈組可見到 Brdu陽性細胞,細胞呈圓形,細胞核是紅色的,尾靜脈組 BrdU陽性細胞在脈絡(luò)叢、腦室管膜周圍、血管周圍分布較多,尾靜脈組的肝組織中也見到少量 Brdu染色陽性的細胞(見圖6、圖7)。(2)免疫雙染結(jié)果:尾靜脈組在移植后 1m后的免疫組化染色時均有 MSCs分化的雙陽性細胞,即 Brdu+NSE、Brdu+GFAP,其中 NSE陽性細胞說明分化為神經(jīng)元,GFAP陽性說明分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞,表現(xiàn)為細胞核紅色,胞漿為藍色(見圖8、圖9)。(3)BDNF檢測結(jié)果:細胞漿中呈棕黃色顆粒者為陽性細胞(見圖10、圖11)。單染結(jié)果用陽性細胞數(shù)表示(見表2)。

表2 MSCs對大鼠腦缺血再灌注后 BDNF表達的影響±s)

表2 MSCs對大鼠腦缺血再灌注后 BDNF表達的影響±s)

與對照組比★P＜0.05

尾靜脈組對照組P值6631.45±0.5112★20.53±0.47760.00322.61±0.6553★16.74±0.37560.01116.80±0.8366★11.50±0.54770.005

圖6 尾靜脈組腦內(nèi)Brdu單染細胞(×100)

圖7 尾靜脈組肝內(nèi)Brdu單染細胞(×100)

圖8 Brdu+NSE免疫雙染細胞(×400)

圖9 Brdu+GFAP免疫雙染細胞(×400)

圖10 BDNF單染胞漿陽性(×400)

圖11 BDNF單染白質(zhì)纖維束陽性(×200)

3 討 論

骨髓是造血器官,干細胞最初的概念也是源于骨髓,骨髓中除了有造血干細胞外,作為間充質(zhì)細胞成分之一的間充質(zhì)干細胞的含量估計只占全骨髓細胞的 1/105[1],因此研究它的體外培養(yǎng)、擴增及純化具有重要的意義。現(xiàn)在各實驗室主要是用 3種方法來分離 MSC,即梯度離心法[2]、貼壁培養(yǎng)法、免疫吸附法[3]。本實驗中我們結(jié)合了密度梯度離心法和貼壁法分離骨髓中的 MSCs,這樣培養(yǎng)的細胞貼壁快,呈集落樣生長,細胞呈均勻一致的紡錘形。通過換液以棄除仍懸浮生長的血細胞、巨噬細胞等雜細胞,使其得以純化,最初分離的細胞是混雜的細胞群,且為多態(tài)的,經(jīng)過 2～3次傳代后 MSCs的形態(tài)就趨于一致,分離培養(yǎng)的 MSCs在顯微鏡下觀察,90%以上為梭形或呈紡錘形的細胞,形成漩渦狀,部分為大的扁平形細胞,即為較高純度的 MSCs。本實驗病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),光鏡下 HE染色可見對照組梗死灶明顯,缺血區(qū)神經(jīng)細胞明顯減少,可見大量神經(jīng)細胞變性、壞死,呈胞體皺縮、核固縮、碎裂、溶解,間質(zhì)水腫明顯,大量炎癥細胞浸潤。尾靜脈移植組神經(jīng)細胞變性、壞死數(shù)量明顯變少,炎癥細胞減少,間質(zhì)水腫減輕。說明 MScs治療缺血性腦損傷是切實有效的。

當(dāng)前 MSCs移植的途徑主要有 3種:立體定向、動脈途徑、靜脈途徑。其中立體定位途徑對受體的腦組織有一定的損傷,動脈途徑移植難度較大,靜脈途徑注射侵襲性小,操作方便、安全。Brazelton[4]研究小組將表達綠色熒光蛋白(GFP)成鼠的 MSCs經(jīng)尾靜脈注入經(jīng)致死量照射的同基因成鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)在嗅球、海馬、皮層、小腦有 GFP細胞。因此我課題組設(shè)計了尾靜脈途徑移植 MSCs,觀察 MSCs在體內(nèi)的存活及分化情況,以及神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)和神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的分泌情況并探討相關(guān)的機制。目前國內(nèi)外研究 MSCs還可促進缺血區(qū)新血管再生[5],Liu等[6]實驗表明用胎盤生長因子(Placental growth factor,PLGF)基因修飾的人 MSCs能誘導(dǎo)腦梗死大鼠腦內(nèi)的血管發(fā)生,促進其損傷功能的恢復(fù)。移植的 MSCs還可促進內(nèi)源性細胞增殖,Crigler等[7]的實驗表明人 MSCs移植后,其不同的細胞亞型表達不同的神經(jīng)細胞調(diào)控分子(軸突誘導(dǎo)因子、軸突導(dǎo)向及神經(jīng)細胞粘附分子),對宿主神經(jīng)細胞的存活和神經(jīng)再生起到了一定的作用。此外還可以分化為神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞發(fā)揮替代作用[8]。本實驗觀察到,移植后 1d時在由于是卒中急性期,興奮性神經(jīng)遞質(zhì)、自由基以及炎性因子可能會威脅進入缺血區(qū)的新細胞,移植的細胞難以發(fā)揮作用及分化,因此兩組的 NSS評分間無統(tǒng)計學(xué)差異。2w、1m、2m、3m時尾靜脈組 NSS評分明顯低于對照組,在移植后 1m時免疫組化染色即可以見到免疫雙陽細胞,可能是MSCs進入到缺血損傷部位,促進內(nèi)源性靜態(tài)的神經(jīng)干細胞被激活以及更容易促進體內(nèi)的細胞因子和神經(jīng)生長因子的分泌,修復(fù)破壞的神經(jīng)環(huán)路,分化后發(fā)揮神經(jīng)替代修復(fù)作用。關(guān)于尾靜脈注射時 MSCs如何通過血腦屏障,可能有幾種機制:(1)腦損傷后血腦屏障的破壞,可能有助于 MSCs選擇性進入缺血腦區(qū)。(2)與受損傷的腦組織釋放一些趨化因子有關(guān)[9]。(3)缺血后細胞間黏附分子的表達增高并相互作用。(4)腦缺血可以誘導(dǎo)缺血周邊區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達,如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、膠質(zhì)細胞源性營養(yǎng)因子(GDNF)[10]、胰島素樣生長因子(IGF-1)[11]等,這些營養(yǎng)因子可能對 MSCs的存活、遷移和分化起重要作用。

本實驗觀察腦缺血性損傷后在不同的時間點移植組的 BDNF陽性細胞數(shù)明顯高于對照組,說明了MSCs移植后能顯著增加腦內(nèi) BDNF的合成,促進缺血性腦損傷的恢復(fù)。這也是尾靜脈移植治療腦缺血損傷的重要機制。BDNF屬于神經(jīng)營養(yǎng)素家族之一,相對分子量為 12.3ku的堿性蛋白。它不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中對神經(jīng)元的生存、分化、生長和維持神經(jīng)元正常的生理功能起關(guān)鍵作用,而且還具有抗傷害刺激、促使神經(jīng)元損傷后的再生。Arai等[12]在一側(cè)大腦中動脈阻塞(MCAO)動物模型上發(fā)現(xiàn),在梗死灶周圍的皮質(zhì)及雙側(cè)的海馬 BDNF及其受體 TrkBmRNA表達明顯增加。BDNF減輕腦缺血神經(jīng)損害的機制有以下幾點:(1)拮抗興奮性氨基酸毒性。(2)穩(wěn)定細胞內(nèi) Ca2+濃度。(3)減輕自由基損傷。(4)抑制神經(jīng)細胞的凋亡。BDNF可通過調(diào)節(jié) Bcl-2、Bax蛋白的表達而抑制細胞的凋亡[13]。

總之,大腦中動脈閉塞(MCAO)的大鼠早期通過尾靜脈移植 MSCs,可在大鼠腦組織中存活并部分分化為神經(jīng)細胞,顯著加速大鼠的神經(jīng)功能的恢復(fù),還可以促進神經(jīng)營養(yǎng)因子 BDNF的分泌增加,為缺血性腦梗死的治療開辟了新的道路,在未來的臨床應(yīng)用中還有許多問題有待于解決,如移植的安全性問題等。

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