金鮮花, 鄭勝哲, 盧 蕾, 宋 磊

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell,NSCs)移植在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)和神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的細(xì)胞替代治療以及基因治療中有著巨大的應(yīng)用價(jià)值,但移植后由于缺血、缺氧的局部微環(huán)境所限,其存活能力差,自我修復(fù)作用微乎其微。因此促進(jìn)細(xì)胞在非理想環(huán)境下的抗凋亡能力成為近年來(lái)神經(jīng)干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。其中最直接的方法之一是將某些抗凋亡基因通過(guò)基因工程導(dǎo)入干細(xì)胞中[1,2]。X盒結(jié)合蛋白 1(XBP-1)基因編碼的 xbp-1蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未折疊蛋白反應(yīng)階段產(chǎn)生的一種重要轉(zhuǎn)錄因子[3～5],在抗凋亡途徑中起重要的保護(hù)作用[6]。本實(shí)驗(yàn)將載有XBP-1基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞,制造 XBP-1過(guò)表達(dá)的神經(jīng)干細(xì)胞模型,探討 CoCl2誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞缺氧模型中,過(guò)表達(dá)基因 XBP-1對(duì)移植后神經(jīng)干細(xì)胞在缺血缺氧下存活能力的影響,并探討其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康孕 16d SD大鼠 20只,體質(zhì)量220～250g,由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(Ji)2003-0002)。重組腺病毒包裝XBP-1基因由廣州易超醫(yī)學(xué)試劑科技公司代為完成。過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG、山羊抗兔 IgG、BSA、BCA試劑盒(武漢意德公司),CoCl2、DMSO、MTT(武漢意得公司),大鼠抗 nestin抗體(Sigma公司),FTIC標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG(Santa cruz公司),凱基 Annexin VFITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司),FACS2Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó) B D公司),DG5031型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)。

1.2 神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 無(wú)菌條件下將 SD孕鼠脫頸處死后取出胎鼠,分離胎鼠海馬組織,用 D-Hanks液漂洗后放入冰冷 DMEM/F12培養(yǎng)液中,用眼科剪剪成約 1mm×1mm×1mm的小塊,再用吸管機(jī)械吹打至單細(xì)胞懸液,然后濾過(guò) 200目細(xì)胞篩,收集入離心管中。800r/min,離心 5min后棄上清,用 DMEM/F12(含 20ng/ml的 bFGF,2%B27,1%的谷氨酰氨,1%雙抗,20ng/ml的 EGF)2ml重新懸浮細(xì)胞后,再反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液。經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)(1×106/ml)后裝入 50ml培養(yǎng)瓶中,置入37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔 3d換半液 1次,每隔 7～10d分離傳代 1次,光學(xué)顯微鏡下觀察各時(shí)期細(xì)胞形態(tài)。取經(jīng)過(guò)二次傳代的神經(jīng)干細(xì)胞,離心 800r/min,5min后取細(xì)胞球沉淀,用少量培養(yǎng)液懸浮細(xì)球后將細(xì)胞球種植于有多聚賴氨酸包被的12孔板中,每孔加入完全培養(yǎng)基(DMEM/F12,10%FCS,P/S)1ml。6h后將懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)用 PBS洗 3次后用 4%多聚甲醛固定 30min。再用用 PBS洗滌 3次后分別加入一抗小鼠抗大鼠 nestin抗體(1∶100),4℃過(guò)夜,再用 PBS洗 3次,加入二抗 FTIC標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG(1∶64),37℃孵育 1h后,于免疫熒光顯微鏡下觀察。

1.3 Ad-xpb1-EGFP轉(zhuǎn)染 NSCs 將培養(yǎng)的第 2代神經(jīng)干細(xì)胞球以 1500r/min離心 5min后用DMEM/F12重懸,用吸管輕輕分吹打開(kāi)使之成為單細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)后以每孔 2×105個(gè)細(xì)胞加入到 96孔板中。將 Ad-xpb1-EGFP病毒分為 4個(gè)不同的濃度,分別為 5×107,1×108,5×108,1×109,每個(gè)滴度加入 10孔,于 37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h,定時(shí)在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞表達(dá)情況。挑選熒光顯微鏡下 EGFP表達(dá)最強(qiáng)干細(xì)胞,進(jìn)一步培養(yǎng)擴(kuò)增備用。

1.4 缺氧模型的構(gòu)建及分組 隨機(jī)選取普通神經(jīng)干細(xì)胞分為 2組,分別記為對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組;隨機(jī)選取轉(zhuǎn)染后神經(jīng)干細(xì)胞設(shè)定為轉(zhuǎn)染組。每組均置于 6孔板中,設(shè) 3個(gè)復(fù)孔/組,每孔中細(xì)胞數(shù)為 5×105個(gè)?？諏?duì)照組中只加入培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組中除培養(yǎng)液外還加入濃度為 150μmol/L的 CoCl 250μl構(gòu)建缺氧模型。將 3組分別放入 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 24h。然后刮取細(xì)胞蛋白,用western blot檢測(cè) grp78,EDEM,bcl-2,bax的含量,Annexin V/PI標(biāo)記法流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組中細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western blot檢測(cè)目的蛋白 分別檢測(cè)對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組中 grp78,EDEM,bcl-2和bax的表達(dá),具體步驟如下:將需檢測(cè)的 NSCs懸液離心 800r/min,5min,收取細(xì)胞蛋白,加入已添加蛋白酶抑制劑的三去污細(xì)胞裂解液,冰上裂解 30min后,離心 12000r/min,20min。總蛋白濃度測(cè)定采取BCA法。每個(gè)樣品取總蛋白 15μg與 6×loading buffer 4μl混合,沸水變性 5min,行 10%SDS-PAGE凝膠電泳分離,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后,BSA加脫脂牛奶封閉膜 2h,TBST洗 6次,10min/次,加一抗(Mouse monoclonal anti-β-actine、rabbit polyclonal anti-XBP-1、rabbit polyclonal anti-grp78、rabbit polyclonal anti-EDEM、rabbit polyclonal anti-bcl-2、rabbit polyclonal anti-bax)(1∶2000)于 4℃孵育過(guò)夜,次日 TBST洗脫 6次,10min/次,再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育 2h后行 ECL化學(xué)發(fā)光法顯示條帶,結(jié)果以各條帶與內(nèi)參 β-actin的灰度值比值表示。

1.6 Annexin V/PI標(biāo)記法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將 3組神經(jīng)干細(xì)胞離心(2000r/min離心5min)收集,用 PBS洗滌細(xì)胞 2次 (2000r/min離心5min)收集(1～5)×105細(xì)胞,加入 Binding Buffer 500μl懸浮細(xì)胞,之后加入 AnnexinV-FITC 5μl,混勻后再加入 PropidiumIodide 5μl,混勻 ,室溫、避光 、反應(yīng) 5～15min,再進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率(%),激發(fā)波長(zhǎng) Ex=488nm;發(fā)射波長(zhǎng) Em=530nm。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)后神經(jīng)干細(xì)胞及傳代細(xì)胞的形態(tài)觀察 原代細(xì)胞培養(yǎng)初期大部分呈近球形懸浮,邊界清楚折光度強(qiáng)。部分細(xì)胞相聯(lián),含少量無(wú)光澤的死細(xì)胞。培養(yǎng) 2d后逐漸形成細(xì)胞團(tuán),折光性較好,部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。7d時(shí)細(xì)胞以神經(jīng)球形式懸浮于培養(yǎng)基中,由數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)細(xì)胞組成,神經(jīng)球中央部分細(xì)胞死亡,見(jiàn)圖1。為防止神經(jīng)干細(xì)胞貼壁后分化,待神經(jīng)球直徑達(dá) 0.1mm左右即機(jī)械分離傳代。傳代后的神經(jīng)干細(xì)胞,仍然形成大量的神經(jīng)球。這些原代和次代神經(jīng)球形態(tài)基本相同,沒(méi)有見(jiàn)到明顯的分化現(xiàn)象。第二代神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng) nestin染色后呈陽(yáng)性,可見(jiàn)整個(gè)細(xì)胞球呈現(xiàn)綠色熒光,見(jiàn)圖2。

圖1 培養(yǎng) 7d時(shí)原代海馬神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài),呈團(tuán)狀生長(zhǎng),形成干細(xì)胞球(×200)

圖2 傳二代海馬神經(jīng)干細(xì)胞 nestin染色,細(xì)胞球呈現(xiàn)綠色熒光(×200)

2.2 獲得成功轉(zhuǎn)染的 NSCs NSCs腺病毒感染 24h即可以出現(xiàn)熒光表達(dá),48h后表達(dá)更強(qiáng),以病毒濃度為 5×108每孔時(shí)熒光表達(dá)最強(qiáng),如圖3。

圖3 EGFP標(biāo)記的轉(zhuǎn)染后海馬NSCs球,熒光鏡下呈強(qiáng)陽(yáng)性(×200)

2.3 神經(jīng)干細(xì)胞中 xbp-1,grp78,EDEM,bax和bcl-2的表達(dá) 質(zhì)粒 Ad-XBP1轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞 48h后收取細(xì)胞蛋白,行 western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染組神經(jīng)神經(jīng)干細(xì)胞中 xbp1含量明顯高于對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)。對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染組相比,xbp1表達(dá)量沒(méi)有明顯差異,見(jiàn)圖4;轉(zhuǎn)染組中g(shù)rp78、EDEM和 bcl-2表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他兩組(P＜0.05),見(jiàn)圖5、6、7;轉(zhuǎn)染組中 bax表達(dá)量高于對(duì)照組,但明顯低于缺氧對(duì)照組(P＜0.05),見(jiàn)圖8。

圖4 轉(zhuǎn)染組神經(jīng)神經(jīng)干細(xì)胞中 xbp1含量明顯高于對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組(*P＜0.05)。對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染組相比,xbp1表達(dá)量沒(méi)有明顯差異

圖5 缺氧轉(zhuǎn)染組grp78含量明顯高于對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組(*P＜0.05)

圖6 缺氧轉(zhuǎn)染組EDEM含量明顯高于對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組(*P＜0.05)

圖7 缺氧轉(zhuǎn)染組bcl-2含量明顯高于對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組(*P＜0.01)

圖8 轉(zhuǎn)染組 bax表達(dá)量高于對(duì)照組,而明顯低于未轉(zhuǎn)染組(*P＜0.05,**P＜0.01)

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 經(jīng) Annexin V/PI標(biāo)記法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),對(duì)照組有少量干細(xì)胞凋亡,凋亡細(xì)胞百分比為(3.37±0.04)%;缺氧轉(zhuǎn)染組神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率為(12.85±0.05)%,明顯低于缺氧對(duì)照組(17.43±0.24)%(P＜0.05),但高于對(duì)照組(P＜0.05),見(jiàn)圖9。

圖9 凋亡和死亡細(xì)胞百分比(圖中右上象限代表死亡細(xì)胞,右下象限代表凋亡細(xì)胞,左下象限代表存活細(xì)胞)

3 討 論

目前認(rèn)為神經(jīng)干細(xì)胞至少具備 4種特性:表達(dá)神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白(neuroepithelial stem cell protein,nestin);具有自我更新和增殖能力;多潛能性,即在特定條件影響或誘導(dǎo)下能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;可塑性,在多數(shù)情況下,成體干細(xì)胞分化為與其組織來(lái)源一致的細(xì)胞,但是在某些情況下,成體干細(xì)胞的分化并不遵循該規(guī)律,表現(xiàn)出很強(qiáng)的跨系或跨胚層分化潛能[7]。本實(shí)驗(yàn)從胚鼠海馬取材,采用機(jī)械分離法制備 NSC懸液,實(shí)驗(yàn)效果比較理想。原代細(xì)胞可以自我更新、增殖,在 7～10d左右形成細(xì)胞球,并出現(xiàn)貼壁分化現(xiàn)象,經(jīng) nestin染色后表達(dá)陽(yáng)性,為下一步實(shí)驗(yàn)提供有效的神經(jīng)干細(xì)胞株。

腺病毒(adenovirus,Ad)是神經(jīng)干細(xì)胞基因工程中的常用載體,其特點(diǎn)是安全性好、穩(wěn)定,無(wú)需整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中,突變致癌可能性小,基因毒性低,容量較大、相對(duì)穩(wěn)定,可以插入 7.5kb的外源基因,經(jīng)得起純化、濃縮[8]。本次實(shí)驗(yàn)采用 Ad攜帶XBP1基因及表達(dá)熒光蛋白的基因 EGFP轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在熒光鏡下呈強(qiáng)陽(yáng)性,說(shuō)明 Ad可以成功將 XBP1導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞中,并且挑選轉(zhuǎn)染后熒光表達(dá)最強(qiáng)的干細(xì)胞株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn),保證了實(shí)驗(yàn)的可行性和嚴(yán)謹(jǐn)性。XBP-1基因編碼的人 X盒結(jié)合蛋白 1(X-box binding protein 1,xbp1)是一種堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)蛋白,為CREB/ATF轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員[9]。它與主要組織相容性復(fù)合物第二家族(ClassⅡmajor histocompatibility complex)中的 Aa,DRa和 DPb基因的 cAMP應(yīng)答元件(CRE)相互作用,與靶基因啟動(dòng)子序列中的 X盒結(jié)合[10]。神經(jīng)干細(xì)胞缺血缺氧時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中會(huì)有未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白蓄積,先產(chǎn)生一種 ATF6的核內(nèi)活性形式—ATF6a[11]。ATF6a通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)順式作用元件(cis-acting ER stress response element,ERSE)激活 XBP1基因。與此同時(shí)IRE1位于的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的結(jié)構(gòu)域發(fā)生二聚化,激活胞質(zhì)的蛋白激酶域,進(jìn)而發(fā)生自身磷酸化作用。胞質(zhì)端蛋白激酶域激活后,進(jìn)一步激活特定位點(diǎn)羧基末端的RNase活化,從而在 XBP1-u特定的內(nèi)含子和外顯子區(qū)域進(jìn)行切割,產(chǎn)生具有高度轉(zhuǎn)錄活性的XBP1-s[12],表達(dá)具有活性的 xbp-1。xbp-1通過(guò)與ERSE反應(yīng)元件結(jié)合誘導(dǎo)糖調(diào)節(jié)蛋白 78(glucoseregulated protein,grp78)的表達(dá)升高,增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊能力,通過(guò)與 UPRE反應(yīng)元件結(jié)合可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解增強(qiáng)因子 α甘露糖苷酶樣蛋白(ER degradation enhancingα-mannosidase-like protein,EDEM)等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解途徑相關(guān)基因的表達(dá)增多,增加泛素化蛋白酶體系對(duì)錯(cuò)誤折疊蛋白的降解,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的蛋白負(fù)荷[13,14]。與此同時(shí),細(xì)胞也通過(guò)PERK-eif-2α途徑激活抑制蛋白質(zhì)翻譯,減少蛋白質(zhì)生成,降低進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白量,避免內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔負(fù)荷進(jìn)一步加重,逐步恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),減輕細(xì)胞損傷而免遭凋亡[15]。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò) Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組的神經(jīng)干細(xì)胞中 grp78、EDEM水平明顯高于對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組,說(shuō)明導(dǎo)入的 XBP1基因可以成功過(guò)表達(dá),并在缺氧情況下成功激活下游抗凋亡通道。并且同時(shí)發(fā)現(xiàn)過(guò)量的 XBP1表達(dá)可以引起 bcl-2水平上升,而 bax水平下降,這在既往的研究中并無(wú)相關(guān)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)最后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)出修飾后的 NSCs凋亡數(shù)目明顯低于未經(jīng)修飾的 NSCs組,驗(yàn)證了 xbp-1抗凋亡能力的作用機(jī)制在神經(jīng)干細(xì)胞中是明確有效的。

本實(shí)驗(yàn)對(duì) XBP1過(guò)表達(dá)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞抗凋亡作用影響只進(jìn)行了初步的研究。由于時(shí)間和條件的限制,在轉(zhuǎn)染中 Ad-XBP1質(zhì)粒的濃度是否合適,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞長(zhǎng)期的增殖能力情況,轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞是否具有致瘤性并沒(méi)有得到進(jìn)一步的有力驗(yàn)證。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 XBP1過(guò)表達(dá)可以顯著增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞的抗凋亡能力,可以為進(jìn)一步研究使用轉(zhuǎn)染后干細(xì)胞治療神經(jīng)損傷動(dòng)物模型如帕金森模型、腦梗死模型提供有力的鋪墊。

[1] Enzmann GU,Benton RL,Woock JP,et al.Consequences of noggin expression by neural stem,glial,and neuronal precursor cells engrafted into the injured spinal cord[J].Experimental.Neurology,2005,195:293-304.

[2] Blurton-Jones M,Kitazawa M,Martinez-Coria H,et al.Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease[J].Proc Natl Acad Sci,2009,106(32):13594-13599.

[3] Xu CY,Beatrice BM.Endoplasmic reticulumstress cell life and death decisions[J].J Clin Invest,2005,115:2656-2664.

[4] Lin JH,Li H,Yasumura D,et al.IRE1 signaling affects cell fate during the unfolded protein response[J].Science,2007,318:944-949.

[5] Yoshida HT,Matsu A,Yamamoto T,et al.XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor[J].Cell,2001,107:881-891.

[6] Kim I,Xu W,Reed JC.Cell death and endoplasmic reticulum stress:disease relevance and therapeutic opportunities[J].Nat Rev Drug Discov,2008,7:1013-1030.

[7] Mckay R.Stem cell in the central nervous system[J].Science,1997,276(5309):66-71.

[8] Iwai M,Abe K,Kitagawa H,et al.Gene therapy with adenovirus-mediated glial cell line-derived neurotrophic factor and neural stem cells activation after ischemic brain injury[J].Hum Cell,2001,14(1):27-38.

[9] Liou HC,Boothby MR,Finn PW,et al.A new member of the leucine zipper class of proteins that binds to the HLA DR alpha promoter[J].Science,1990,247:1581-1582.

[10] Kokura K,Kishimoto T,Tamura T,et al.Identity between rat htf and human xbp-1 genes:determination of gene structure,target sequence,and transcription promotion function for HTF[J].Gene,2000,2:360-366.

[11] Xu CY,Maitre BB.Endoplasmic reticulum stresscell life and death decisions[J].JClin Invest,2005,115:2656-2664.

[12] Calfon MH,Zeng F,Urano JH,et al.IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA[J].Nature,2002,415:92-96.

[13] Oda Y,Hosokawa N,Wada I,et al.EDEM as an acceptor of terminally misfolded glycoproteins released from calnexin[J].Science,2003,299:1394-1397.

[14] Yamamoto K,Yoshida H,Kokame K,et al.Differential contributions of ATF6 and XBP1 to the activation of endoplasmic reticulum stressresponsive cis-acting elements ERSE,UPRE and ERSE-II[J].J Biochem,2004,136:343-350.

[15] Liu HJ,Yang JP,Wang CH.Endoplasmic reticulum in the penumbra following middle cerebral artery occlusion in the rabbit[J].Neurol Sci,2009,30:227-232.