方勤美,黃紹謙,俞伏松,朱繼昌,林天龍

豬鏈球菌2型福建分離株的主要毒力基因分析*

方勤美,黃紹謙,俞伏松,朱繼昌,林天龍

目的為了解福建地區(qū)豬鏈球菌2型菌株毒力因子分布情況。方法選取谷氨酸脫氫酶(gdh)、莢膜多糖(cps)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、胞外因子(ef)、溶血素(sly)、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白(fbps)及毒力相關(guān)序列orf2等7個(gè)豬鏈球菌2型主要毒力基因,分別設(shè)計(jì)了7對(duì)引物,采用PCR方法,對(duì)本室分離保存的豬鏈球菌2型福建分離株的毒力基因進(jìn)行分析。結(jié)果從屠宰生豬體內(nèi)分離的4個(gè)豬鏈球菌2型菌株和SS2PFJ07株基因型為gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fbps+/orf2+,另1株從生豬體內(nèi)分離的分離菌株基因型為gdh+/cps2J+/mrp+/ef+/sly+/fbps+/orf2+。結(jié)論福建地區(qū)生豬中豬鏈球菌2型至少有兩種毒力基因型。

豬鏈球菌2型;福建分離株;毒力基因

豬鏈球菌2型是一種重要的人獸共患病病原,不同的豬鏈球菌2型菌株的致病力存在明顯差異,而這種差異可能與各菌株的毒力因子分布情況有很大關(guān)系〔1〕。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)豬鏈球菌2型的毒力因子分布與致病力之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。目前認(rèn)為豬鏈球菌2型的毒力因子主要包括谷氨酸脫氫酶(GDH)、莢膜多糖(CPS)、溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、溶血素(SLY)、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白(FBPS)及毒力相關(guān)序列ORF2等。本研究選取了7對(duì)主要毒力基因引物進(jìn)行PCR檢測(cè),以了解福建無(wú)癥狀生豬豬鏈球菌2型的毒力因子的分布情況,并與國(guó)內(nèi)毒力因子表型分布情況作比較,對(duì)福建分離株的基因型分布情況作初步分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 PFJ07分離自病豬淋巴結(jié),PFJ080820和PFJ080842分離自無(wú)癥狀生豬扁桃體,PFJ080913、PFJ080942和PFJ080943分離自無(wú)癥狀生豬鼻咽拭子,上述菌株經(jīng)本室2008年9月分離鑒定后保存。豬鏈球菌2型參考菌株(JA070109)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院陸承平教授惠贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 THB液體培養(yǎng)基和綿羊血平板購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,ExTaq酶、dNTP、DNA Marker(DL-2000)、蛋白酶 K 均購(gòu)自TaKaRa公司,細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1.3 主要儀器PCR儀(Eppendorf,AG22331),臺(tái)式離心機(jī)(Thermo,PICO17),核酸電泳儀(Hoefer,HE33),自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD,Gel DOC2000)。

1.4 引物合成 參照文獻(xiàn)〔2〕合成7對(duì)引物,其序列、退火溫度及擴(kuò)增片度大小見(jiàn)表1,各引物均由大連寶生物工程有限公司合成。

表1 PCR反應(yīng)引物及目的片段大小Table 1 The primer sequences and product size

1.5 模板制備 保存菌株先接種綿羊血平板,置37℃培養(yǎng)18 h后,挑取單菌落接種于THB液體培養(yǎng)基,37℃靜置培養(yǎng)18 h。取各檢測(cè)菌種新鮮培養(yǎng)菌液1 mL離心棄上清,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作提取模板DNA,分裝,置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR反應(yīng)體系 PCR擴(kuò)增均采用25 μ L反應(yīng)體系包括:10×PCR緩沖液(含25mmol/L MgCl2)2.5 μ L,10mmol/L dNTPs 2 μ L,上下游引物(10mmol/L)各0.6 μ L,ExTaq 酶(5U)0.15 μ L,模板 2 μ L,用去離子水調(diào)整終體積至25 μ L。反應(yīng)結(jié)束后各取5 μ L于1%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

2 結(jié) 果

5株 SS2福建分離株,4株基因型為gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fbps+/orf2+,1株基因型為gdh+/cps2J+/mrp+/ef+/sly+/fbps+/orf2+,實(shí)驗(yàn)室從病豬分離的SS2PFJ07基因型為gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/f bps+/orf2+(見(jiàn)表 2)。所有菌株的電泳圖見(jiàn)圖1至7。

以下各圖中:M.MarkerDL2000;1.PFJ080820;2.PFJ080842;3.PFJ080913;4.PFJ080942;5.PFJ080943;6.PFJ07;7.XT060821;8.空白對(duì)照.

3 討 論

豬鏈球菌2型并不都具有致病性,根據(jù)菌株致病力的差異,將其分為強(qiáng)致病力菌株、弱致病力菌株以及無(wú)致病力菌株。先前的研究發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌2型致病力的差異與該菌株的毒力因子有著密切的聯(lián)系。Smith等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)插入突變得到的無(wú)莢膜的等位基因突變株在體外很容易被豬肺泡巨噬細(xì)胞攝入,更重要的是,通過(guò)鼻腔接種無(wú)菌仔豬的突變株對(duì)其完全無(wú)致病性,由此可見(jiàn),莢膜多糖與細(xì)菌致病力有關(guān)。曾巧英等〔4〕研究證明MRP可單獨(dú)作為豬鏈球菌2型的毒力因子。由于M RP和EF在強(qiáng)毒株中檢出率很高,在非致病菌株中檢出率很低,因而MRP和EF常被認(rèn)為是豬鏈球菌2型高致病性的標(biāo)志〔5〕。SLY 對(duì)Hep-2細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和Vero細(xì)胞均具有一定的毒性作用,且經(jīng)純化后溶血素免疫的小鼠和豬均能耐受強(qiáng)毒株的攻擊,所以推測(cè)其可能是豬鏈球菌2型的一種重要的致病因子,也是一種保護(hù)性抗原〔6〕。然而,豬鏈球菌2型的溶血素基因分布具有很強(qiáng)的地域性,來(lái)自歐洲的大多數(shù)菌株能產(chǎn)生溶血素,而來(lái)自北美的菌株不產(chǎn)生溶血素,但仍然具有致病性〔1〕。據(jù)相關(guān)研究證實(shí)基于GDH蛋白的檢測(cè)可區(qū)分豬鏈球菌2型的強(qiáng)毒株、弱毒株和無(wú)毒株,同時(shí),GDH也與豬鏈球菌的種屬有關(guān)〔7〕。De Greef A 等〔8〕用缺乏 FBPS 的突變株與野毒株同時(shí)共同感染無(wú)菌仔豬,結(jié)果表明FBPS在細(xì)菌定植某些靶器官的過(guò)程中起一定作用。毒力相關(guān)序列orf2在強(qiáng)弱毒株之間的序列存在差異,這種差異可能與菌株致病性有關(guān)〔9〕。

表2 豬鏈球菌2型的毒力因子檢測(cè)Table 2 The detection of virulent factor in SS2

了解福建地區(qū)豬鏈球菌2型分離株的毒力因子分布情況,有助于進(jìn)一步了解福建地區(qū)SS2分離株的毒力基因型,為豬鏈球菌2型的防控提供科學(xué)依據(jù)。因此本研究選取上述7種主要毒力因子,通過(guò)對(duì)福建地區(qū)豬鏈球菌2型分離株進(jìn)行PCR檢測(cè),研究發(fā)現(xiàn)從鼻咽拭子中分離的豬鏈球菌2型菌株都缺乏EF和SLY這兩個(gè)毒力因子,從扁桃體上分離的豬鏈球菌2型菌株有一株也缺乏以上兩種毒力因子,另一株同時(shí)具有7種主要毒力因子。豬鏈球菌2型菌株的毒力因子表型分布是否與其存在部位有一定的關(guān)系,還有待進(jìn)一步的研究。由于分離的菌株數(shù)量有限,因此福建地區(qū)生豬豬鏈球菌2型分離株的毒力基因型是否主要為gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fbps+/orf2+,還有待對(duì)更多生豬豬鏈球菌2型分離株進(jìn)行檢測(cè)。

趙冉等〔10〕研究結(jié)果表明25株國(guó)內(nèi)致病性豬鏈球菌2型分離株,96%(24/25)具有上述7種毒力基因,僅一株缺失ef,提示我國(guó)目前SS2流行菌株的毒力基因型主要為同時(shí)具有上述7種毒力基因的基因型;李春玲等〔11〕研究結(jié)果也顯示我國(guó)健康豬豬鏈球菌扁桃體分離株毒力基因分布較為復(fù)雜,而且豬鏈球菌2型的優(yōu)勢(shì)流行菌株的毒力基因型為同時(shí)具有多種毒力基因的基因型。呂立新等〔12〕從健康生豬扁桃體中分離到一株同時(shí)含有上述7種毒力基因的豬鏈球菌2型。從上述可知本試驗(yàn)從健康生豬扁桃體中分離的具有7種毒力基因的菌株的基因型為國(guó)內(nèi)優(yōu)勢(shì)基因型。據(jù)報(bào)道在國(guó)內(nèi)豬扁桃體分離株中也發(fā)現(xiàn)一些新的基因型cps2J+/mrp+/ef-/sly-、cps2J+/mrp+/ef+/sly-、cps2J+/mrp*/ef-/sly-和cps2J+/mrp-/ef-/sly-,而本研究從生豬體內(nèi)分離的其余4株豬鏈球菌2型與從福建地區(qū)病豬分離到的豬鏈球菌2型的基因型為gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/f bps+/orf2+,因此其為新的基因型。本試驗(yàn)結(jié)果表明福建地區(qū)生豬中豬鏈球菌2型至少有兩種毒力基因型。福建地區(qū)是否存在其它基因型還有待對(duì)更多的分離株進(jìn)行檢測(cè)。

〔1〕路玲玲,李蓉,鄭玉玲,等.2型豬鏈球菌毒力因子研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,18(3):570-572.

〔2〕俞伏松,車勇良,郭長(zhǎng)明,等.豬鏈球菌2型福建株的分離鑒定〔J〕.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2008,37(3):290-294.

〔3〕Smith H,Damman M,Van,Der,Velde J,et al.Identification and characterization of the cps locus ofStreptococcus suisserotype 2:the capsule protects against phagocytosis and is an important virulencefactor〔J〕.InfectImmun,1999,67(4):1750-1756.

〔4〕曾巧英,陸承平.豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白誘導(dǎo)上皮細(xì)胞融合和凋亡〔J〕.微生物學(xué)報(bào),2003,43(3):407-411.

〔5〕Norton P,Rolph C,Ward P,et al.Epithelial invasion and cell lysis by virulent strains ofStreptococcus suisis enhanced by the presence of suily sin〔 J〕.FEMS Immunol M ed Microbiol,1999,26(1):25-35.

〔6〕Staats J,Plattner B,Stewart G,et al.Presence of the Streptococcus suis suily sin gene and ex pression of M RP and EF co rrelates with high virulence inStreptococcus suistype 2 isolates〔J〕.Vet Microbiol,1999,70(3-4):201-211.

〔7〕Okwumabua O,Persaud J,Reddy P.Cloning and characterization of the gene encoding the glutamate dehydrogenase ofStreptococcus suisserotype 2〔J〕.Clin Diagn Lab Immunol,2001,8(2):251-257.

〔8〕De,Greeff A,Buy s H,Verhaar R,et al.Contribution of fibronectin-binding protein to pathogenesis ofStreptococcus suisserotype 2〔J〕.Infect Immun,2002,70(3):1319-1325.

〔9〕李干武,姚火春,陸承平.在豬鏈球菌2型江蘇分離株中發(fā)現(xiàn)新的orf2毒力相關(guān)基因〔J〕.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2003,11(3):295-298.

〔10〕趙冉,孫建和,陸承平.豬鏈球菌國(guó)內(nèi)分離株毒力因子的分布特征〔J〕.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版),2006,24(6):495-498.

〔11〕李春玲,余煒烈,賈愛(ài)卿,等.豬鏈球菌扁桃體分離株的毒力因子分布特征與致病性〔J〕.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,31(2):104-109.

〔12〕呂立新,何孔旺,倪艷秀,等.從正常屠宰豬扁桃體中分離到致病性豬鏈球菌2型〔J〕.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2008,24(4):379-383.

Genetic analysis on the main virulence genes in the Fujian strain ofStreptococcus suistype 2 from slaughtered pigs

FANG Qin-mei,HUANG Shao-qian,YU Fu-song,ZHU Ji-chang,LIN Tian-long

(Instituteof Biotechnology,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou350003,China)

To investigate the distribution of virulence associated factors of 5 strains ofStreptococcus suistype 2 from slaughtered pigs isolated in Fujian province,7 virulence genes were detected through PCR amplification.They were the glutamate dehydrogenase gene(gdh),the capsular polysaccharides gene(cps),the extracellular factor gene(ef),the muramidate-released protein gene(mrp),the suilysin gene(sly),the fibronectin-binding protein gene(fbps)and the virulence-associated sequence or f2.Among these 5 strains isolated,the virulence genotypes of 4 strainsS.suistype 2 and strain SS2PFJ07 was gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fbps+/orf2+and the other one strain isolated from slaughtered pigs was gdh+/cps2J+/mrp+/ef+/sly+/fbps+/orf2+respectively.This results showed that there are at least 2 virulence genotypes in Streptococcus suis type 2 from slaughtered pigs isolated in Fujian province.

Streptococcussuistype 2;Fujian strain;virulence-associated gene

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

1002-2694(2010)01-0065-04

*福建省科技廳項(xiàng)目(2006F3024、2006NZ0003-2、2006N0021)

林天龍,Email:lint05@163.com

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,福州 350003

2009-08-07;

2009-10-20