張麗榮,林毅雄,李紅霞,魏泉德,張靜濤,方艷梅,周蘭蘭,鄭予柯

珠海市2007-2008年乙型流感病毒基因特性分析*

張麗榮,林毅雄,李紅霞,魏泉德,張靜濤,方艷梅,周蘭蘭,鄭予柯

目的了解珠海市近兩年乙型流感病毒的基因變異情況。方法采集珠海市流感樣病例樣本進(jìn)行流感病毒的分離和鑒定,并對(duì)分離到的乙型流感病毒進(jìn)行核酸的提取,采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增病毒基因后進(jìn)行病毒血凝素HA1基因核苷酸序列測(cè)定,用Mega、DNA Star、GeneDoc軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析處理,并與WHO推薦的疫苗株基因序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果2007-2008年分離的乙型流感毒株分屬于Yamagata系和Victoria系兩個(gè)譜系,譜系內(nèi)毒株間距離很近。Yamagata系毒株與B/Brisbane/3/2007的核苷酸同源性極高,在99.4%～99.7%之間;Victoria系乙型流感病毒株與B/Malasia/2506/2004的核苷酸同源性亦很高,在98.6%～99.1%之間。與疫苗株和其它流行株相比,本次分離的兩個(gè)譜系毒株均未發(fā)現(xiàn)核苷酸的丟失和插入,但均增加一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。結(jié)論珠海市人群交替流行著Yamagata系和Victoria系兩個(gè)抗原性不同的進(jìn)化系的乙型流感病毒,病毒的基因發(fā)生了變異。2007-2008兩年WHO推薦的乙型流感疫苗株與我地區(qū)當(dāng)年流行株為不同譜系毒株,預(yù)防保護(hù)效果不好。

乙型流感病毒;血凝素基因;核苷酸序列;Yamagata系;Victoria系

乙型流感病毒是流感的主要病原之一,乙型流感病毒只有一個(gè)亞型,自1985年以來,乙型流感病毒根據(jù)抗原性和基因特征的不同分為兩大譜系Yamagata系和 Victoria系〔1〕,代表株分別為 B/Yamagata/16/88和 B/Victoria/2/87,兩個(gè)譜系的病毒株在遺傳和抗原水平上是不同的〔2〕。近20年來的監(jiān)測(cè)分析表明,乙型流感兩大譜系輪換著流行〔3-6〕,人群獲得的免疫力迅速失效,因而兩大譜系得以持續(xù)流行。

流感病毒主要是通過病毒外膜蛋白,特別是血凝素蛋白(hemagglutinin)的重鏈區(qū)HA1的變異來改變抗原特性以逃避機(jī)體已有的免疫保護(hù),從而在人群引起反復(fù)流行〔7〕。因而通過分析乙型流感病毒HA1區(qū)的變異情況,找出變異規(guī)律,對(duì)于流感流行的預(yù)測(cè)、疫苗株的篩選具有重要意義。

由于乙型流感病毒主要是在局部地區(qū)流行,所以加強(qiáng)各地區(qū)的流感監(jiān)測(cè)分析有著重要意義。因此,為了解珠海市乙型流感病毒的變異情況,我們于2007-2008年對(duì)流感樣病例進(jìn)行了監(jiān)測(cè),并對(duì)部分分離的乙型流感病毒毒株進(jìn)行了HA1序列測(cè)定及分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2007-2008年珠海市流感樣病例的咽拭子標(biāo)本。

1.2 病毒分離培養(yǎng)及鑒定 將流感樣病例標(biāo)本接種狗腎傳代細(xì)胞(MDCK)培養(yǎng),有細(xì)胞病變(CPE)、血凝實(shí)驗(yàn)陽性的培養(yǎng)液送廣東省CDC進(jìn)行型別鑒定。

1.3 病毒RNA提取 使用Qiagen Viral RNA Mini Kit提取病毒株RNA,按說明書操作。

1.4 HA1區(qū)全基因核苷酸序列擴(kuò)增 引物1:5'-CCACAAAATGAAGGCAATAA;引物 2:5'-CCTGTGTAGTAAGGCT TGCTT,引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。將所選取的樣品RNA進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增HA1基因全長。反應(yīng)參數(shù):50℃30min,1個(gè)循環(huán);95℃2min,1個(gè)循環(huán);95℃30s,55℃30s,72℃1.5min,35個(gè)循環(huán);72℃10min,4℃。PCR完成后,用1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果,擴(kuò)增片段為985bp。

1.5 序列測(cè)定和分析 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序采用ABI3730型自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行。序列結(jié)果用Mega、DNA Star、GeneDoc軟件進(jìn)行分析。同時(shí)選取2007-2008年北半球乙型流感疫苗株及一些國內(nèi)代表株的血凝素(HA)基因進(jìn)行序列和種系進(jìn)化分析。疫苗株及國內(nèi)代表株的序列均來自Influenza Sequence Database。

2 結(jié) 果

2.1 2007-2008年珠海市乙型流感病毒流行情況

2007年采集流感樣病例樣本986份,用MDCK細(xì)胞分離出流感病毒60株,其中乙型流感病毒11株,占18.3%,從5-9月每月均有乙型流感病毒分離,2007年分離的11株乙型流感病毒全部為Yamagata系。

2008年采集流感樣病例樣本1 523份,用MDCK細(xì)胞分離出流感病毒141株,其中乙型流感病毒30株,占21.3%,除1、2、6月份之外每月均有乙型流感病毒分離。2008年我市人群中乙型流感兩個(gè)譜系同時(shí)存在,但以Victoria系毒株為主。

2.2 2007-2008年珠海市乙型流感病毒HA1區(qū)核苷酸和氨基酸序列分析 分別隨機(jī)挑選各5株2007年和2008年不同月份分離到的乙型流感毒株,對(duì)其血凝素基因進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定,將其與近年流行株進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),Yamagata系毒株與B/Brisbane/3/2007的核苷酸同源性極高,在99.4%～99.7%之間,與B/Florida/4/2006的核苷酸同源性較高,在97.3%～97.6%之間(見表1);Victoria系乙型流感病毒株與B/Malasia/2506/2004的核苷酸同源性較高,在 98.6%～99.1%之間,與 B/Shenzhen/155/05的同源性亦較高,在 98.9%～99.3%之間(見表2)。

表1 2007-2008年珠海市Yamagata系乙型流感病毒HA1區(qū)核苷酸序列同源性比較Table 1 Analysis on the homology of nucleotide acids of hemagglutinin gene HA1 of Yamagata-like strain of influenza virus B in 2007-2008 in Zhuhai

通過核苷酸進(jìn)化樹可見,2007-2008年10株乙型流感病毒分布在Yamagata系和Victoria系兩個(gè)分支上,6株 Yamagata系分離株與疫苗株B/Brisbane/3/2007和B/Florida/4/2006距離很近,4株Victoria系分離株與B/Malasia/2506/2004和B/Shenzhen/155/05距離很近(見圖1)。

分別將各株核苷酸序列推導(dǎo)出氨基酸序列。有研究表明乙型流感HA1基因的第70-90位和第110-210位上的氨基酸參與乙型流感病毒抗原表位的構(gòu)成〔8〕,其間氨基酸的變異會(huì)導(dǎo)致病毒抗原性改變。本次分離的Yamagata系的6個(gè)毒株與B/Florida/4/2006相比較,發(fā)生了4處氨基酸替換,分別是第48位精氨酸→賴氨酸,第88位賴氨酸→精氨酸,第108位脯氨酸→丙氨酸,第229位絲氨酸→甘氨酸,與B/Brisbane/3/2007相比較,發(fā)生 2處氨基酸替換,即第182位谷氨酰胺→谷氨酸,第196位天冬氨酸→天冬酰胺,而196位的氨基酸替換使毒株在196-198位上的氨基酸形成Asn-Lys-Thr的結(jié)果,導(dǎo)致在該處增加了一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。

圖1 2007-2008年珠海市乙型流感病毒HA1區(qū)核苷酸基因進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of HA1 gene of influenza B viruses isolated in Zhuhai in 2007-2008

二處變異位點(diǎn)均位于HA1抗原區(qū)表位(見圖2)。

表2 2007-2008年珠海市Victoria系乙型流感病毒HA1區(qū)核苷酸序列同源性比較Table 2 Analysis on the homology of nucleotide acids of hemagglutinin gene HA1 of Victoria-like strain of influenza virus B in 2007-2008 in Zhuhai

2008年4株Victoria系乙型流感病毒,與B/Malasia/2506/04相比,在 HA1基因的第 70-90位區(qū)域未發(fā)現(xiàn)氨基酸變異。而在110-210區(qū)域,與B/Shenzhen/155/05相同,均在134號(hào)位點(diǎn)發(fā)生絲氨酸→脯氨酸的替換,與B/Shenzhen/155/05不同的是,有二個(gè)分離株190/2008和955/2008在165位出現(xiàn)了天冬酰胺到賴氨酸的替換,并且4株分離株均在199位出現(xiàn)了丙氨酸→蘇氨酸的替換,使毒株在197-199位上的氨基酸形成Asn-Glu-Thr的結(jié)果,導(dǎo)致在該處增加了一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)(見圖3)。

圖2 2007-2008年珠海市Yamagata系乙型流感病毒HA1區(qū)氨基酸序列分析“-”表示氨基酸序列相同,“—”表示糖基化位點(diǎn)Fig.2 Amino acid analysis of HA1 gene of Yamagata-like strain of influenza B viruses isolated in Zhuhai in 2007-2008

3 討 論

流感病毒的抗原變異與流感的發(fā)生和流行密切相關(guān),流感病毒正是通過不斷改變其抗原性來逃避宿主特異性免疫識(shí)別和清除,從而不斷地引起流行。HA蛋白是流感病毒的主要抗原之一,其抗體能中和流感病毒的感染〔9〕。流感病毒HA基因,主要是HA1編碼區(qū)在持續(xù)不斷地、快速地發(fā)生突變,乙型流感病毒HA1區(qū)氨基酸的替換主要集中于70～90位和110～210位,有研究認(rèn)為這2個(gè)部位與乙型流感病毒的抗原決定簇有關(guān),此區(qū)間氨基酸的改變會(huì)導(dǎo)致病毒抗原性的改變〔3-4〕。

圖3 2007-2008年珠海市Victoria系乙型流感病毒HA1區(qū)氨基酸序列分析“-”表示氨基酸序列相同,“—”表示糖基化位點(diǎn)Fig.3 Amino acid analysis of HA1 gene of Victoria-like strain of influenza B viruses isolated in Zhuhai in 2007-2008

監(jiān)測(cè)顯示珠海市2007年乙型流感病毒以Yamagata系為優(yōu)勢(shì)株。2007-2008年分離的Yamagata系毒株與疫苗株B/Brisbane/3/2007比較,HA1區(qū)在110-210位有2個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變化,分別為182(Q→E)和 196(D→N),由于196位出現(xiàn)了Asn替換Asp,使毒株在該處形成Asn-Glu-Thr,導(dǎo)致在該處增加了一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。2008年分離的乙型流感病毒以Victoria系為優(yōu)勢(shì)株,分離的4個(gè)毒株與WHO推薦的06-07年乙型流感Victoria系疫苗株B/Malasia/2506/04比較,其 HA1區(qū)134(S→P)和199(A→T)發(fā)生變異,由于在199位點(diǎn)發(fā)生 Thr替換Ala,使得在197位點(diǎn)增加了1個(gè)糖基化位點(diǎn)。流感病毒血凝素蛋白糖基化的主要作用是穩(wěn)定血凝素蛋白結(jié)構(gòu),防止血凝素被水解以及阻礙抗體的識(shí)別,所以糖基化位點(diǎn)對(duì)血凝素的結(jié)構(gòu)和功能十分重要。乙型流感病毒株HA1區(qū)氨基酸位點(diǎn)的替換和糖基化位點(diǎn)的增加,使得其抗原性發(fā)生了改變。因此,根據(jù)WHO疫苗推薦株生產(chǎn)的疫苗對(duì)該年我市乙型流感預(yù)防效果并不理想。監(jiān)測(cè)顯示,2007-2008年珠海市均有乙型流感病毒流行,且引起小的暴發(fā)。

2007-2008年WHO推薦的北半球乙型流感疫苗株屬于Yamagata系毒株,2008年監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示本市人群中同時(shí)流行著乙型Yamagata系和Victoria系毒株,而以Victoria系為優(yōu)勢(shì)毒株,因此本年度的乙型流感疫苗對(duì)珠海市的乙型流感不能提供最佳的保護(hù)。提示在今后疫苗成分中應(yīng)考慮我國流感的流行特點(diǎn),最好包括乙型流感病毒兩個(gè)譜系毒株的成分。

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Characteristic analysis on HA1 gene of influenza virus B,isolated from 2007 to 2008 in Zhuhai

ZHANG Li-rong,LIN Yi-xiong,LI Hong-xia,WEI Quan-de,ZHANG Jing-tao,FANG Yan-mei,ZHOU Lan-lan,ZHENG Yu-ke
(Zhuhai Centre for Disease Control and Prevention,Zhuhai519000,China)

To understand the variation of hemagglutinin gene HA1 in influenza virus B and evaluate the protective effect of the vaccine strains recommended by WHO,respiratory specimens were collected from the suspected cases in Zhuhai.The influenza viruses were isolated from the specimens and furtherly typed by serological identification.The HA1 genes were sequenced and the data were analyzed by software of Mega,DNA Star and GeneDoc.The results showed that the viruses of Yamagata lineage and Victoria lineage were isolated.The homology of strains in Yamagata lineage and nucleotide acids of B/Brisbane/3/2007 was 99.4%-99.7%.Similarly,the homology of strains in Victoria lineage and nucleotide acids of B/M alasia/2506/2004 was 98.6%-99.1%.Comparing with the vaccine strains and other epidemic strains,there was no deletion or insertion of nucleotide acid in both lineages,but there was a glycosylation site acquired in all the isolated virus strains.It's suggested that the two different lineages of Yamagata and Victoria prevailed alternatively in Zhuhai during 2007 to 2008,and the variation of gene was occurred during these years.As the vaccine strains recommended by WHO were different from the epidemic strains in Zhuhai in lineage,the protective effect was unsatisfied.

influenza virus B;hemagglutinin gene;nucleotide sequence;Yamagata lineage;Victoria lineage

R373.1

A

1002-2694(2010)09-0847-04

*珠海市衛(wèi)生局資助項(xiàng)目(2007068)

珠海市疾病預(yù)防控制中心,珠海 519000;Email:lirongmuzhang@126.com

2009-11-23;

2010-01-16