徐靜嫻，劉冰陽(yáng)，森井英一，青世克之，賈心善，張勁松

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第四醫(yī)院眼科中心，眼科醫(yī)院，遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110005；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 第93期臨床醫(yī)學(xué)7年制，沈陽(yáng) 110001；3.大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)院病態(tài)病理教研室，日本 大阪 565-0871；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110001）

癌干細(xì)胞是一小群具有在瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成克隆，在體內(nèi)移植分析中形成腫瘤的能力的細(xì)胞。癌干細(xì)胞最初發(fā)現(xiàn)于白血病［1］。近期研究發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)期培養(yǎng)的某些細(xì)胞株中也存在癌干細(xì)胞［2］。熒光染料Hoechst 33342對(duì)普通的癌細(xì)胞具有著色作用，但具有干細(xì)胞特性的癌細(xì)胞對(duì)該染料卻具有排除能力，因此應(yīng)用Hoechst 33342染色可分離癌干細(xì)胞。在熒光激活細(xì)胞分選分析中，帶有較低水平Hoechst 33342染色的細(xì)胞被看作是具有癌干細(xì)胞特性的SP（side-population）細(xì)胞，相反，帶有較高水平Hoechst 33342染色的細(xì)胞被看做是非SP細(xì)胞，即MP（main-population）細(xì)胞，不具有癌干細(xì)胞的特性。Kondo等［2］報(bào)告只有SP細(xì)胞既能生成SP細(xì)胞又能生成MP細(xì)胞，而MP細(xì)胞不具備這種能力。目前，利用SP細(xì)胞分選法來(lái)分離干細(xì)胞的方法已廣泛應(yīng)用于氣管干細(xì)胞、肺癌干細(xì)胞的研究中［3］。

癌干細(xì)胞對(duì)凋亡具有抵抗性，但其機(jī)制目前尚不清楚。對(duì)癌干細(xì)胞進(jìn)行抗凋亡能力分析困難的原因之一，就是分離癌干細(xì)胞時(shí)使用的Hoechst 33342染料具有能夠誘導(dǎo)凋亡的毒性作用［4］。應(yīng)用熒光激活細(xì)胞分選分離出來(lái)的SP細(xì)胞內(nèi)包含的Hoechst 33342量比MP細(xì)胞低，SP細(xì)胞對(duì)凋亡的耐受性可能歸因于Hoechst 33342的低含量，而非SP細(xì)胞本身的特性。因此，為了精確評(píng)估凋亡，SP細(xì)胞應(yīng)使用不含有Hoechst 33342的系統(tǒng)進(jìn)行分離。本研究以人類乳腺癌細(xì)胞株MCF7和MDA-MB-231為研究對(duì)象，應(yīng)用Hoechst 33342染色及抗CD55抗體染色，分離出SP和MP細(xì)胞、CD55高表達(dá)（CD55hi）和CD55低表達(dá)（CD55lo）細(xì)胞，對(duì)比了2群細(xì)胞的特性，探討了應(yīng)用抗CD55抗體染色替代Hoechst 33342染色來(lái)分離乳腺癌SP細(xì)胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

人類乳腺癌細(xì)胞株MCF7和MDA-MB-231分別購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞中心（Rockville，美國(guó)）和日本科學(xué)研究資源庫(kù)（HSRRB，日本）。培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FCS）的 DMEM（Sigma，美國(guó)）培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 分選SP、MP細(xì)胞：采用Goodell等［5］分離SP細(xì)胞的方法，將細(xì)胞以1×106/ml的濃度加入2組培養(yǎng)基中∶第一組培養(yǎng)基中含Hoechst 33342 5 mg/ml，第二組培養(yǎng)基中除了5 mg/mlHoechst 33342外，另加入了戊酸丙胺（verapamil，50 mmol/ml）。37℃培養(yǎng)90 min后，收集細(xì)胞。應(yīng)用含有三維激光的FACSVantage（Becton Dickinson公司，美國(guó)）進(jìn)行分析，識(shí)別SP及MP細(xì)胞，分離并收集。

1.2.2 分選CD55hi、CD55lo細(xì)胞：將細(xì)胞以1×106/ml的濃度加入含2%FCS的PBS溶液中，再加入藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的濃度為 5 ml/ml的抗CD55抗體（Immunotech公司，法國(guó)），避光染色30 min后，應(yīng)用FACS Vantage SE分析，確定CD55hi與CD55lo細(xì)胞，分離并收集。

1.2.3 測(cè)定存活細(xì)胞比例：清洗細(xì)胞，用不含血清的DMEM懸浮，在96孔培養(yǎng)板中（5×103/孔）培養(yǎng)12或24 h后，行臺(tái)盼藍(lán)染色，通過(guò)隨機(jī)計(jì)數(shù)5×102個(gè)細(xì)胞計(jì)算臺(tái)盼藍(lán)陰性細(xì)胞的比例。

1.2.4 體外克隆形成分析：用0.1 ml的含10%FCS的DMEM培養(yǎng)基懸浮清洗后的細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，放入1 ml含15%FCS的DMEM的甲基纖維素培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d后，計(jì)數(shù)克隆形成的數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)均以±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP、MP細(xì)胞的分選

用Hoechst 33342染色并應(yīng)用FACS-Vantage儀分析分選MCF7細(xì)胞，結(jié)果顯示SP細(xì)胞占3.9%（圖1A），在含有戊酸丙胺的溶液中，SP細(xì)胞比例明顯降低（從3.9%降至0.03%）（圖1B）。對(duì)分選后的SP和MP細(xì)胞再行抗CD55抗體染色，可見(jiàn)SP和MP細(xì)胞分別位于CD55hi和CD55lo區(qū)域（圖1D）。

2.2 CD55hi、CD55lo細(xì)胞的分選

MCF7細(xì)胞用抗CD55抗體染色后被分別作為CD55hi和CD55lo細(xì)胞分選出來(lái)。CD55hi細(xì)胞的比例約占0.8%～1.3%。對(duì)分選出的CD55hi和CD55lo細(xì)胞行Hoechst 33342再染色，可見(jiàn)分別位于SP和MP區(qū)域中（圖2A～C）。

2.3 血清缺失誘導(dǎo)凋亡分析

對(duì)MCF7細(xì)胞的SP和MP細(xì)胞進(jìn)行分選、清洗后，用不含血清的試劑懸浮，測(cè)定到SP細(xì)胞中存活細(xì)胞的比例（12 h時(shí)為93%，24 h時(shí)為65%）比MP細(xì)胞中（12 h時(shí)為79%，24 h時(shí)為34%）高（圖1C，P<0.01），表明在血清缺失的情況下，SP細(xì)胞比MP細(xì)胞存活時(shí)間長(zhǎng)。同樣，在血清缺失的情況下，甄選出的CD55hi細(xì)胞也比CD55lo細(xì)胞存活時(shí)間長(zhǎng)（圖2D）。

2.4 克隆形成能力分析

在含有15%FCS的含甲基纖維素的DMEM培養(yǎng)基中加入CD55hi和CD55lo細(xì)胞，CD55hi細(xì)胞所形成的克隆數(shù)（51.0±5.8）明顯多于CD55lo細(xì)胞（5.3±2.3）（P<0.01）。

2.5 MDA-MB-231細(xì)胞株的檢測(cè)結(jié)果

我們同時(shí)對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231也進(jìn)行了SP、MP細(xì)胞及CD55hi、CD55lo細(xì)胞的分選及血清缺失誘導(dǎo)凋亡耐受性的分析，結(jié)果與MCF7細(xì)胞相似。

3 討論

目前，適合SP細(xì)胞分離的表面標(biāo)記還很有限。ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2（ATP-binding cassette transporter G2，ABCG2）是骨髓 SP 細(xì)胞的標(biāo)志，然而ABCG2敲除鼠并沒(méi)有完全喪失乳腺SP細(xì)胞［6］。我們預(yù)測(cè)SP細(xì)胞一定能夠表達(dá)某種表面分子，并起到保護(hù)細(xì)胞免受外源傷害刺激的作用。CD55可能就是這種合適的分子之一。CD55是一種補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，它能夠防止補(bǔ)體因子在細(xì)胞表面的蓄積［7］，在保護(hù)癌干細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)攻擊方面可能起重要作用。CD55的過(guò)度表達(dá)也是結(jié)腸癌愈后不良的可靠指征［8］，在巨大淋巴瘤中，CD55的表達(dá)水平與腫瘤的大小及耐藥性呈正相關(guān)［9］，在SCID鼠中，CD55的表達(dá)敲除降低了前列腺癌細(xì)胞株的腫瘤起源性［10］。

本研究根據(jù)CD55的表達(dá)水平成功分離出了乳腺癌SP和MP細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2種乳腺癌細(xì)胞株中SP細(xì)胞的CD55為高表達(dá)；分選的CD55hi和CD55lo細(xì)胞，再用Hoechst 33342染色時(shí)，分別位于SP和MP區(qū)域中；分選的SP和MP細(xì)胞，再用抗CD55抗體染色時(shí)，則分別位于CD55hi和CD55lo區(qū)域中；在血清缺失的情況下，CD55hi和CD55lo細(xì)胞分別顯示了與SP和MP細(xì)胞相似的行為，即CD55hi細(xì)胞與SP細(xì)胞在體外同樣顯示出對(duì)血清缺失誘導(dǎo)凋亡的高耐受性；CD55hi細(xì)胞較CD55lo細(xì)胞在體外具有更強(qiáng)的克隆形成能力。綜上所述，在乳腺癌中，CD55hi和CD55lo細(xì)胞分別可以代替SP和MP細(xì)胞，即應(yīng)用細(xì)胞CD55高表達(dá)的特性可以替代Hoechst 33342染色來(lái)分離乳腺癌SP細(xì)胞。

本研究結(jié)果提示，CD55hi（SP）細(xì)胞比CD55lo（MP）細(xì)胞對(duì)凋亡刺激具有更高的抵抗性。因此，CD55可以推測(cè)為乳腺癌干細(xì)胞的一個(gè)表面標(biāo)志，有可能成為針對(duì)癌干細(xì)胞治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。進(jìn)一步的研究（包括分離CD55hi細(xì)胞、評(píng)估其腫瘤起源性）將會(huì)更深入揭示在癌干細(xì)胞分離中CD55高表達(dá)的作用。

［1］Lessard J，Sauvageau G.Bmi-1 determined the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells ［J］.Nature，2003，423（6937）：255-260.

［2］Kondo T，Setoguchi T，Taga T.Persistence of a small subpopulation of cancerstem-likecellsintheC6gliomacellline［J］.ProcNatlAcad Sci USA，2004，101（3）：781-786.

［3］Song N，Jia XS，Jia LL，et al.Expression and role of Oct3/4，Nanog，Sox2 in the regeneration of rat tracheal epithelium ［J］.Cell Prolif，2010，43（1）：49-55.

［4］Zhang X，Chen J，Davis B，et al.Hoechst 33342 induces apoptosis in HL-60 cells and inhibits topoisomerase I in vivo［J］.Arch Pathol Lab Med，1999，123（10）：921-927.

［5］Goodell MA，Brose K，Paradis G，et al.Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo［J］.J Exp Med，1996，183（4）：1797-1806.

［6］Jonker JW，F(xiàn)reeman J，Bolscher E，et al.Contribution of the ABC transporters bcrp1 and mdr1a/1b to the side population phenotype in mammary gland and bone marrow of mice［J］.Stem Cells，2005，23（8）：1059-1065.

［7］Spendlove I，Ramage JM，Bradley R，et al.Complement decay accelerating factor （DAF）/CD55 in cancer［J］.Cancer Immunol Immunother，2006，55（8）：987-995.

［8］Durrant LG，Chapman MA，Buckley DJ，et al.Enhanced expression of the complement regulatory protein CD55 predicts a poor prognosis in colorectal cancer patients ［J］.Cancer Immunol Immunother，2003，52（10）：638-642.

［9］Terui Y，Sakurai T，Mishima Y，et al.，Blockade of bulky lymphomaassociated CD55 expression by RNA interference overcomes resistance to complement-dependent cytotoxicity with rituximab［J］.Cancer Sci，2006，97（1）：72-79.

［10］Loberg RD，Day LL，Dunn R，et al.Inhibition of decay-accelerating factor（CD55）attenuates prostate cancer growth and survival in vivo［J］.Neoplasia，2006，8（1）：69-78.