劉冬妍，丁鵬，劉沛

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，沈陽 110004；2.附屬第一醫(yī)院感染科，沈陽 110001）

肝壞死是一類肝細(xì)胞廣泛壞死的晚期病癥，患者可出現(xiàn)消化道出血、內(nèi)毒素血癥、自發(fā)性腹膜炎、肝性腦病、中毒性鼓腸、甚至敗血癥等。腸黏膜免疫系統(tǒng)在機(jī)體擔(dān)任第一線的局部防御任務(wù)，黏膜免疫是抑制免疫不是激活免疫［1］，黏膜免疫系統(tǒng)由許多機(jī)制抵抗各種損傷以保護(hù)宿主，如分泌性免疫球蛋白（secretory IgA，SIgA）、腸上皮淋巴細(xì)胞。腸黏膜SIgA是腸道第一線的免疫防御，對黏膜固有的和入侵的病原體具有保護(hù)作用，尤其對腸道菌群中的G-桿菌具有特殊的親和力［2］，阻止其與腸上皮細(xì)胞的吸附，避免細(xì)菌穿透腸上皮發(fā)生易位，是阻止細(xì)菌易位的重要環(huán)節(jié)。因而在探討急性肝壞死并發(fā)自發(fā)性腹膜炎發(fā)生機(jī)制時(shí)，研究腸道SIgA變化至關(guān)重要。本研究檢測急性肝壞死動(dòng)物模型血清、糞便內(nèi)SIgA，并檢測腸壁內(nèi)IgA的蛋白定位，以了解急性肝壞死腸道免疫防御功能的改變。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及動(dòng)物模型建立

由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供雄性Balb/C小鼠250只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，隨機(jī)分為4組。1組：生理鹽水對照組，50只；2組：LPS（E.coliO127：B8） 組，50 只；3 組：D-氨基半乳糖組（GalN組），50只；4組：肝壞死組（LPS+GalN 組），100只。各組分 5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（2，6，9，12，24 h），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取10 只小鼠。GalN 800 mg/kg，LPS 10 μg/kg，均為腹腔注射，生理鹽水為相同體積的腹腔注射，在不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠取肝腸組織。

1.2 標(biāo)本的處理

（1）摘眼球取血，待充分凝固后，3 000 r/min離心取上清，-30℃冰凍保存待用；（2）取干便稱重，按1/10加入pH7.4的PBS，漩渦振蕩器充分震蕩后以10 000 r/min低溫離心機(jī)離心，取上清-30℃冰凍保存待用。

1.3 ELISA方法檢測血清、糞便IgA

用抗小鼠IgA抗體（Sigma公司）包被96孔聚苯乙烯反應(yīng)板4℃過夜。10%小牛血清封閉，依次加入標(biāo)本、生物素標(biāo)記的抗小鼠IgA抗體（Sigma公司）、卵白素耦聯(lián)的辣根過氧化物酶（Sigma公司）和底物，用硫酸終止反應(yīng)，以包被液做空白對照，封閉液做陰性對照，450 nm波長檢測吸光度值（A值）［3］。

1.4 放射免疫方法檢測糞便SIgA

從冰箱中取出糞便上清液和血清平衡到室溫，設(shè)立非特異標(biāo)準(zhǔn)管、零標(biāo)準(zhǔn)管、6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管、T管。T管僅加I125-SIgA，非特異標(biāo)準(zhǔn)管加I125-SIgA和非特異結(jié)合試劑，零標(biāo)準(zhǔn)管加I125-SIgA和SIgA抗體，6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管加I125-SIgA、SIgA抗體和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，樣品管依次加入100 μl標(biāo)本、I125-SIgA和SIgA抗體，充分混勻，37℃溫育1.5 h，加入第二抗體和PEG，充分混勻，37℃孵育0.5 h，3 500 r/min離心15 min，棄上清，沉淀和T管在γ閃爍技術(shù)儀上計(jì)數(shù)60 s，計(jì)數(shù)非特異結(jié)合率。

1.5 腸上皮IgA免疫組化染色

頸椎脫臼處死小鼠，取腸組織，迅速放入福爾馬林中，石蠟包埋后切成6 μm厚切片，常規(guī)二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，然后依次加入H2O2、兔血清、1∶800稀釋的抗SC抗體（美國ICN公司）、生物素標(biāo)記的IgG抗體、酶標(biāo)記的卵白素、DAB顯色。用圖像分析軟件分析SC染色的平均OD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以±s表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物死亡情況

第4組小鼠注射以后，出現(xiàn)懶動(dòng)，攝水、覓食減少，皮毛松散，甚至抽搐，于注射后6 h開始死亡，9 h達(dá)高峰，死亡率達(dá)56%。

2.2 動(dòng)物模型腸、肝組織形態(tài)學(xué)檢查

2.2.1 肝組織：HE染色光鏡下由LPS/GalN引起的急性肝壞死隨時(shí)間逐漸加重，2 h肝臟有少量點(diǎn)狀壞死，6 h肝臟出現(xiàn)多處點(diǎn)狀壞死，9 h、12 h可見成片的出血性壞死，殘存的肝細(xì)胞腫脹，壞死區(qū)可見大量炎細(xì)胞。24 h有多處點(diǎn)狀壞死，肝細(xì)胞腫脹，多處出血，灶狀壞死處有淋巴細(xì)胞浸潤（圖1）。

2.2.2 腸組織：HE染色光鏡下見對照組腸絨毛完整，無上皮脫落及碎屑形成，壞死組部分絨毛不整，細(xì)胞水腫及炎細(xì)胞浸潤（圖2）。

2.3 糞便SIgA的變化

LPS引起的肝壞死小鼠便SIgA含量升高與對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），在9 h達(dá)到高峰，注射LPS、GalN亦引起便SIgA含量升高（圖3）。

2.4 糞便、血液IgA的變化

注射LPS+GalN 6 h便、血清IgA開始升高，維持到24h，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖4。

2.5 腸上皮IgA變化

IgA染色可見正常腸組織腸上皮細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和固有層活化淋巴細(xì)胞呈棕黃色強(qiáng)陽性；急性肝壞死腸組織腸上皮細(xì)胞質(zhì)陽性明顯減弱（圖5），IgA的光密度變化如圖6。

3 討論

腸道在嚴(yán)重疾病伴發(fā)的多器官功能衰竭中起主要作用［4］，在此過程中腸道黏膜SIgA是一個(gè)重要參與因素，它能阻止細(xì)菌［5］、病毒［6～8］和其他毒性分子粘附在黏膜表面。

我們應(yīng)用LPS和GalN聯(lián)合注射建立急性肝壞死動(dòng)物模型，GalN是一種氨基糖，在肝內(nèi)通過半乳糖途徑代謝，消耗半乳糖代謝途徑的中間產(chǎn)物尿苷二磷酸，進(jìn)而抑制尿嘧啶核苷的代謝，通過抑制肝細(xì)胞RNA和漿膜蛋白的合成造成肝細(xì)胞破壞［9］。GalN可使動(dòng)物對LPS的敏感性呈萬倍的增加，而肝壞死引起的內(nèi)毒素血癥進(jìn)一步加重GalN的肝毒性［10］。對實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，由LPS和GalN引起的急性肝壞死隨時(shí)間逐漸加重，在9 h最重，可見肝臟體積明顯變大，顏色呈醬紫色，HE染色可見成片的出血性壞死，殘存的肝細(xì)胞腫脹，壞死區(qū)可見大量炎細(xì)胞。國外有報(bào)道嚴(yán)重酒精性肝病時(shí)血清SIgA顯著增高，腸道SIgA顯著下降［11］，但也有報(bào)道在酒精性肝病時(shí)腸道IgA明顯升高［12］。慢性病毒性肝炎和肝硬化患兒唾液和糞便濾過液SIgA升高，呈現(xiàn)高球蛋白血癥癥狀，局部免疫功能增強(qiáng)［13］。用螺旋菌誘導(dǎo)的慢性活動(dòng)性肝炎小鼠糞便和膽汁內(nèi)IgA均顯著高于正常對照組［14］。我們結(jié)果顯示，注射后壞死組糞便IgA和SIgA、血液IgA均顯著高于對照組、LPS組、GalN 組（P<0.01），在 9 h達(dá)最高，即肝壞死越重，血清IgA和便中IgA、SIgA越高。小鼠SC介導(dǎo)IgA運(yùn)輸不僅在腸道而且可以在肝臟，由于肝細(xì)胞IgA泵的缺失導(dǎo)致血清IgA升高，大量IgA堆積肝臟，同時(shí)由于IgA的腸肝循環(huán)［15］，肝臟內(nèi)的IgA通過腸肝循環(huán)進(jìn)入腸道引起糞便中IgA增加，因此小鼠糞便IgA不能反映腸道真實(shí)IgA的分泌情況［16］。我們對腸組織進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)由LPS+GalN引起的IgA免疫組化光密度明顯低于對照組、LPS組。因此我們推測即使便中SIgA、IgA升高，但在急性肝壞死時(shí)由于腸黏膜上皮細(xì)胞表面IgA（SIgA）減少，導(dǎo)致腸道免疫功能下降。同時(shí)急性肝壞死時(shí)腸道營養(yǎng)不良可能也是引起腸黏膜上皮細(xì)胞表面IgA減少的原因。由于IgA是SIgA的重要組成成分，SIgA又是腸道第一線免疫防御，因此IgA減少可能是急性肝壞死并發(fā)腹膜炎的一個(gè)原因。

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