謝天卉,趙 鑫,路 璐,吳 迪,付 娜

(哈爾濱工業(yè)大學城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室,哈爾濱 150090)

氫氣以其清潔、高效、可再生等特點,成為人們理想的能源載體之一.產(chǎn)生氫氣的方法有很多種,其中發(fā)酵法生物制氫技術(shù)以其環(huán)境友好、不消耗化石燃料、產(chǎn)生清潔能源等特點,日漸得到人們的關注[1-3].但產(chǎn)氫效率不高始終制約著發(fā)酵法生物制氫技術(shù)的規(guī)?；M程.分離篩選高效產(chǎn)氫細菌,并為優(yōu)化生態(tài)因子是解決該問題的方法之一[4-5].

Ethanoligenens harbinenseYUAN-3(哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌)[6-8]是從乙醇型發(fā)酵生物制氫反應器中分離得到一株產(chǎn)氫細菌,其主要液相代謝產(chǎn)物為乙醇和乙酸.該細菌不僅具有較高的產(chǎn)氫效能,而且具有自凝集的特性,易形成菌粒而沉降在反應器中,避免菌種流失,適合工程應用.

初始 pH值是影響產(chǎn)氫細菌生長和產(chǎn)氣的重要生態(tài)因子之一,大多數(shù)產(chǎn)氫細菌的最適 pH值都集中在中性,pH值過高或過低都會制約產(chǎn)氫細菌的發(fā)酵過程,影響細菌代謝.Enterobacter HO-39的產(chǎn)氫最適 pH值范圍是 6.0～7.0,并可以在 pH值為 3.3的酸性環(huán)境產(chǎn)氣[9];Citrobacter Y19的最適產(chǎn)氫 pH范圍也是 6.0～7.0,但是在 pH值為 4.0時,喪失產(chǎn)氫能力[10].因此,探討 pH值對產(chǎn)氫細菌 E.harbinenseYUAN-3的產(chǎn)氫和生長的影響對揭示其生理生態(tài)學特性具有重要的意義.本文利用E.harbinenseYUAN-3作為研究對象,研究了不同初始 pH值對其生長、產(chǎn)氫等方面的影響,以期能夠為菌株 YUAN-3在實際工程中的應用提供指導.

1 材料與方法

1.1 菌株

產(chǎn)氫細菌 Ethanoligenens harbinense YUAN-3[6-8],分離自活性污泥,由本實驗室保存.

1.2 間歇產(chǎn)氫實驗

將處于對數(shù)生長期的菌體以 10%(V/V)的比例接種到不同磷酸鹽質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中,在間歇實驗裝置上進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫實驗,35℃條件下,130 r/min振蕩培養(yǎng),排水法測定氣體體積.培養(yǎng)基組分如下:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 4 g/L,酵母粉 1 g/L,NaCl 4 g/L,MgCl2·6H2O 0.1 g/L,FeSO4·7H2O 0.1 g/L,L-半胱氨酸 0.8 g/L.通過磷酸氫二鈉和檸檬酸的不同配比使培養(yǎng)基的初始 pH值分別為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和 8.0,考察初始 pH值對于 YUAN-3生長、產(chǎn)氣等情況的影響,每組 5個平行樣.

1.3 發(fā)酵產(chǎn)物的分析

液相產(chǎn)物測定使用 Agilent 4890型氣相色譜儀,30m×0.53 mm HP-FFAP熔融石英毛細管柱,氫火焰檢測器,氮氣作載氣,流速 60m L/min,氫氣流速 60mL/min,進樣口、爐溫、檢測器溫度分別為 220、180、300 ℃.樣品在 5 000 r/min下離心15 min,取上清液 1 m L,加入一滴 6 mol/L HCl溶液,取 1μL進樣.

氣相產(chǎn)物測定使用另外一臺 Agilent 4890型氣相色譜儀,其中 15 m×0.530 mm毛細管柱(19095P-QO3,Agilent),熱導檢測器,氮氣作載氣,進樣量 500μL.

生物量主要用細胞干重來衡量.發(fā)酵結(jié)束后,將發(fā)酵液在 5 000 r/min下離心收集菌體,經(jīng)生理鹽水重懸、洗滌 2次后 80℃下烘干至恒重,稱重葡萄糖的測定采用上海榮盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的葡萄糖(Glu)測定試劑盒——GOD-PAP法pH值采用 pH-S25型酸度計進行測量.

2 試驗結(jié)果與討論

2.1 pH值對 YUAN-3生長的影響

YUAN-3在試驗的各個 pH值都表現(xiàn)出一定的生長能力,見圖1.在 pH值 4.0時,YUAN-3的細胞干重最小,為 0.34 g/L-培養(yǎng)基.隨著 pH值的不斷增加,細菌的生物量也逐漸增加.在 pH值7.0時,細胞干重達到最大,為 0.59 g/L-培養(yǎng)基,此后細菌生物量略有下降.可見 YUAN-3在中性和弱酸的 pH值范圍內(nèi),都可以很好的生長,并保持較高的生物量.

通常情況下,乙醇型生物制氫反應器的 pH值維持在 4.5～5.0左右,而將 YUAN-3投加到生物制氫反應器中是一種很好的生物強化的手段.盡管在初始pH值 4.5～5.0的范圍內(nèi)并不是 YUAN-3生長最旺盛的階段,但 YUAN-3在弱酸的情況下,依然能夠保持較高的生物量,說明 YUAN-3具有較高的應用價值.

圖1 初始 pH值對 YUAN-3生長的影響

2.2 pH值對 YUAN-3產(chǎn)氣能力的影響

隨著初始 pH值的提高,生物氣、氫氣以及氫氣的含量(V/V)都呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(圖2).在 pH值為 6.0時,生物氣和氫氣均達到最大,分別為 1 886 m L/L-culture和 997 mL/L-cul ture,此時的氫氣體積含量也達到最大為 52.8%在 pH值從 4.0到 8.0的范圍內(nèi),YUAN-3均能產(chǎn)氣,且在 pH值大于 4.5開始,YUAN-3的產(chǎn)生氫氣的體積百分含量始終大于 40%,說明 YUAN-3是一株具有較強耐酸能力的產(chǎn)氫細菌,能夠在弱酸性環(huán)境中維持較高的產(chǎn)氫能力.

圖2 初始pH值對YUAN-3產(chǎn)氣能力的影響

隨著初始 pH值的不斷增加,YUAN-3的平均產(chǎn)氫速率和比產(chǎn)氫率也先升高再逐漸降低(圖3).在 pH值為 6.0時,平均產(chǎn)氫速率達到最大,為5.75mmolH2/g-CDW·h,隨后呈逐漸降低的趨勢.這說明,在 pH值為 6.0時,產(chǎn)氫細菌具有較高的細胞產(chǎn)氫活性,pH值過低會抑制細菌的生長和產(chǎn)氫;pH值高于 6.0時細菌的產(chǎn)氫量略有下降,細胞活性有所降低.同樣 YUAN-3的比產(chǎn)氫率也在pH值為 6.0時達到最大,為 2.32 molH2/mol-葡萄糖.這說明此時的細菌還具有良好的葡萄糖轉(zhuǎn)化率.

圖3 初始 pH值對 YUAN-3平均產(chǎn)氫速率和比產(chǎn)氫率的影響

2.3 pH值對 YUAN-3液相末端產(chǎn)物的影響

發(fā)酵液相末端產(chǎn)物主要是乙醇和乙酸,二者的量都隨 pH值升高而呈先增加再降低的趨勢(圖4),這種現(xiàn)象與細菌的產(chǎn)氫的情況是一致的.液相末端產(chǎn)物的增加主要是由于中性范圍更有利于YUAN-3的發(fā)酵造成的.本次發(fā)酵利用的是緩沖溶液,故緩沖溶液的緩沖能力在發(fā)酵結(jié)束的 pH值得以體現(xiàn),隨著初始 pH值的增加,發(fā)酵結(jié)束時的pH值略有升高.在初始 pH值為 4.0時,發(fā)酵終止時 pH值為 3.78,而初始 pH值為 8.0時,發(fā)酵終止時的 pH值為 4.65.初始 pH值在 6.0～7.0時,發(fā)酵終止的 pH值有所下降,是因為在這個初始pH值范圍,發(fā)酵進行的相對徹底,產(chǎn)生了大量的乙酸,導致此時 pH值有小幅的下降.而后來終止時的 pH值又逐漸升高,一方面是因為初始 pH值較高,另一方面是因為發(fā)酵過程相對于 pH值 6.0～7.0來說,進行不夠徹底.平時未使用緩沖溶液時,發(fā)酵終止時 pH值常常低于 3.5,可見緩沖溶液在發(fā)酵過程中發(fā)揮了一定作用,在一定程度上減緩了pH值下降的速度,但是由于乙酸的大量產(chǎn)生,緩沖溶液并不能改變 pH值下降的趨勢.

圖4 初始pH值對 YUAN-3代謝產(chǎn)物的影響

此外 YUAN-3具有自凝集的能力,能夠通過細菌的互相包裹形成菌粒而沉降在培養(yǎng)基底部,培養(yǎng)基自始至終都是清澈的.在不同的 pH值,YUAN-3形成的菌粒大小不同,用肉眼觀察在 pH值從5.0～8.0的范圍內(nèi),YUAN-3形成的菌粒平均直徑可以達到 4～5 mm,而 pH值小于 5.0,形成的菌粒直徑明顯變小,只有 2mm左右,可見 pH值也在一定程度上影響 YUAN-3的凝集能力.

3 結(jié) 語

通過間歇試驗考察不同 pH值對于產(chǎn)氫細菌YUAN-3生長和產(chǎn)氣的影響,可以發(fā)現(xiàn)在初始 pH值為 7.0時,細胞干重達到最大,為 0.59 g/L-培養(yǎng)基.在含有緩沖體系的培養(yǎng)基初始 pH值為 6.0時,平均產(chǎn)氫速率和比產(chǎn)氫率都達到最大,分別為5.75 mmolH2/g-CDW· h和 2.32molH2/mol-葡萄糖.因此,可以將 YUAN-3的初始培養(yǎng)基 pH值范圍控制在 6.0～7.0,可以獲得更多產(chǎn)氫活性較高的產(chǎn)氫細菌.YUAN-3可以在弱酸性環(huán)境中生長和產(chǎn)氣,是一株具有工程應用價值的產(chǎn)氫細菌.

[1] 李建政,任南琪.生物制氫技術(shù)的研究與發(fā)展[J].能源工程,2001,(2):18-20.

[2] DAS D,NEJAT V T.Hydrogen production by biological processes:a survey of literature[J].Int.J.Hydrogen Energy,2001,26:13-28.

[3] MIYAKE J,MASTSUNAGA T,PIETRO A S.Biohydrogen II:an Approach to Environmentally Acceptable Technology[R].Elsevier Science Ltd.2001,15:3-32.

[4] OH S,VAN GS,LOGAN BE.The relative effectiveness of pH control and heat treatment for enhancing biohydrogen gas production[J].Environ.Sci.Technol.,2003,37:5186-5190.

[5] OH Y K,SEOL E H,LEE E Y,et al.Fermentative hydrogen production bya new chemoheterotrophic bacterium Rhodopseudomonas Palustris P4[J].Int.J.of Hydrogen Energy,2002,27 1373-1379.

[6] XING D,REN N.Ethanoligenens harbinense gen.nov.,sp nov.,isolated from molasses waste water[J].Int.J.Syst Evol.Microbiol.,2006,56(4):755-760.

[7] XING D,REN N,WANG A,et al.Continuous hydrogen production ofauto-aggregative Ethanoligenensharbinense YUAN-3 under non-sterile condition[J].Int.J.Hydrogen Energy,2008,33:1489-1495.

[8] RENN,XIE T,XING D.Composition of extracellular polymeri substances influences the autoaggregation capability of hydroge-producing bacterium Ethanoligenens harbinense[J].Bioresource Technol,2009,100(21):5109-5113.

[9] YOKOIH,TOKUSHIGE T,HIROSE J,et al.Hydrogen production by immobilized cellsof Enterobacter aerogenesstrain HO-39[J].J.Ferment.Bioeng,1997,83(5):481-484.

[10] OH Y K,SEOL E H,KIM JR,et al.Fermentative biohydrogen production by a new chemoheterotrophicbacterium Citrobacter sp.Y 19[J].Int.J.Hydrogen Energy,2003,28:1353-1359.