徐 海 陳 斌 金華嶺 徐 剛 張新江

江蘇揚州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 揚州 225000

NSCs是指存在于神經(jīng)系統(tǒng)中特定的前體細胞,其基本的生物學特征為多向分化和自我更新,獨特的生物學特性使其較其他細胞更容易在新的環(huán)境中生存,發(fā)揮生物學作用。神經(jīng)干細胞一直被認為是細胞替代治療帕金森病的理想載體,但是神經(jīng)干細胞如何分化為具有功能的多巴胺能神經(jīng)元一直是個難題。Pitx3[1-2]稱為垂體同源盒家族因子3,是決定中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元表型、終末分化和生存維持的關鍵性特異性轉(zhuǎn)錄因子,TH是DA合成限速酶通常作為DA能神經(jīng)元的特異性標志,表達情況是神經(jīng)干細胞能否轉(zhuǎn)化為多巴胺能神經(jīng)元的關鍵。因此,本文探討胚胎大鼠腹側中腦區(qū)域NSCs的培養(yǎng)過程中pitx3,TH以及凋亡基因的表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:E14.5 d的胚胎大鼠由東南大學實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗試劑:DMEM/F12(1∶1)(Dulbecco's Modified Eagle Medium,F12 Nutrient Mixture,Gibco公司),N2,無血清培養(yǎng)液添加劑B27(B27 Supplement,Gibco公司)。表皮生長因子EGF(epidiermal growth factor,EGF,Gibco公司),堿性成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor-Basic,bFGF,Gibco公司).胎牛血清(fetal bovine serum,gibco)小牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA,Cat.No.A3156),RNA提取試劑盒(QENGEN),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Product No.205213,Qiagen,Germany),Lightcycler system(Roche Diagnostics,Switzerland)。

1.1.3 實驗設備:CO2培養(yǎng)箱(日本三洋)、醫(yī)用超凈工作臺(吳江市凈化設備總產(chǎn),凈化等級100級)、體視顯微鏡(OLYMPUS-CK2)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代克隆的培養(yǎng):取E14.5 d妊娠SD大鼠,嚴格消毒大鼠的腹部皮膚,在劍突下剪開皮膚至下腹部,取出胚胎,將其放入無菌冰凍D-Hank's液中,小心分離腦組織,在解剖鏡下剔除腦膜和血管,鈍性分離中腦組織。將分離出來的中腦組織充分剪碎,置于細孔尼龍網(wǎng)中,用玻璃試管底輕輕碾磨,再通過70μm孔徑的尼龍網(wǎng)過濾,并用吸管輕輕吹打成細胞懸液。室溫1000 r/min離心5 min。棄上清,加入增殖培養(yǎng)基中,按細胞濃度1×105接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi),置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基的基本成分為DMEM/F12(1∶1)1%N2,1%B27,EGF 20 ng/mL,bFGF 20 ng/mL,培養(yǎng) 4～5 d后加入1 mL新鮮培養(yǎng)液,8～9 d后觀察生長的懸浮神經(jīng)細胞球的大小和數(shù)目。

1.2.2 細胞克隆實驗:將傳至第二代的細胞球懸液用毛細吸管從培養(yǎng)瓶中吸出,轉(zhuǎn)入10 mL離心管中,將離心管靜置10 min,待細胞球沉入管底后吸去上清液。將細胞球吸出,用吸管吹打成單細胞懸液,用臺盼藍法鑒定細胞活性,用無血清培養(yǎng)液將單細胞懸液的細胞濃度稀釋成40個細胞/μL,將上述稀釋好的單細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中,每孔50 μL,另加完全培養(yǎng)液100μL,置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng),2 h后在倒置顯微鏡下觀察。選取僅有1個細胞的培養(yǎng)孔作標記,每天在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察所標記的孔中細胞的分裂及克隆形成情況。

1.2.3 細胞RNA的提取并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA:取傳代前的細胞克隆作為對照組。在單細胞克隆形成的7、14、21 d分別收集懸浮細胞,RNA試劑盒按說明步驟提取細胞總RNA。用紫外分光光度計測量RNA在260 nm和280 nm兩個波長的吸光度,并根據(jù)OD值定量。各個樣本分別取10μL RNA,以Oligo(d T)作為引物,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的標準步驟加入相應底物和酶,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.4 Real-time PCR反應:本試驗所用為Real-time PCR系統(tǒng)為 Lightcycler系統(tǒng),β2-Microglobulin為內(nèi)參。見表 1。Real-time PCR反應所用試劑見表2。

表1 所用的相關引物

表2 Real-time PCR反應所用試劑及用量

圖1 pitx3 Reaal-time PCR結果

1.2.5 數(shù)據(jù)分析處理:所有實驗重復3次以保證結果的可靠性。每個時間點選取3組細胞克隆,Real-time PCR結果取平均值。每個時間點的結果與對照組做比較(以百分數(shù)表示),對照組的結果設為1。最后的結果取 3次實驗結果的平均數(shù)。

2 結果

2.1 單細胞克隆 見圖1。原代培養(yǎng)的NSCs在培養(yǎng)最初的3～4 d,可見培養(yǎng)瓶底有許多小圓形死亡細胞及其碎片,大部分存活細胞在培養(yǎng)液中懸浮,10 d左右形成含有上百個細胞的細胞球。體外培養(yǎng)8～9 d后將神經(jīng)細胞球機械吹散成單細胞懸液,置于同樣條件下培養(yǎng)。可觀察到懸浮的單個細胞分裂增殖并形成細胞小球。細胞球可以進一步增長,形成近百個無突起、形態(tài)和大小基本相似的細胞組成的神經(jīng)球。

2.2 Real-time PCR反應結果 見圖2。

圖2 pitx3、Bax和Bcl-2基因表達

3 討論

目前,在成年哺乳動物中,先后在SVZ區(qū)、紋狀體、海馬齒狀回和脊髓中分離得到NSCs。但人們研究發(fā)現(xiàn),不同部位分離得到的NSCs其生長速度、分化方向、遷移特性等生物學特征有很大的不同[3]。關于mNSCs的研究多集中在DA能神經(jīng)元表型的誘導上,在過去數(shù)年的研究中表明它們在分化誘導的遺傳學和分子調(diào)控及DA能神經(jīng)元表型成熟等許多方面都具有自己的特征性[4]。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子pitx3和TH在多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[5]。因此本文選取胚胎大鼠腹側中腦區(qū)域進行NSCs的培養(yǎng),觀察pitx3、TH以及凋亡的相關基因進行研究,為細胞移植治療PD的應用研究打下基礎。

研究表明,干細胞在腦中所處的部位已經(jīng)預定其發(fā)育特征因而表現(xiàn)出不同的生長和分化特性。例如室管膜周圍的NSCs,很早即被決定了特定的發(fā)育方向,這也是為何最先發(fā)育成型的是脊髓,隨后是延髓、腦橋、中腦、間腦、再次是端腦,最后是小腦。由于DA能神經(jīng)元主要存在于腹側中腦,因此人們推測在此區(qū)域的NSCs更容易分化為DA能神經(jīng)元,以前的實驗結果也證實了這一點。近年來,人們發(fā)現(xiàn)和DA能神經(jīng)元發(fā)育密切相關的基因(內(nèi)源性信號),如Enl、Otx2、pitx3、Nurrl、Lmx1b、Shh、FGF8 等,在大鼠胚胎 E14.5 d時,已經(jīng)表達在腹側中腦的NSCs上[5],也就是說,這些NSCs已經(jīng)含有中腦源性的轉(zhuǎn)錄因子和相關的發(fā)育信號,能迅速對相關區(qū)域性的分子信號作出反應從而分化為DA能神經(jīng)元。

在本實驗中我們選擇的培養(yǎng)體系中NSCs生長迅速,狀態(tài)良好,細胞數(shù)量得以大量擴增。實驗的結果表明,在培養(yǎng)過程中,pitx3基因的表達從7～21 d呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢,并且促進凋亡的基因Bax也表現(xiàn)出相同的趨勢,并伴隨著抑制凋亡的基因Bcl-2表達的下調(diào)。結果說明,胚胎大鼠腹側中腦源性神經(jīng)干細胞具有分化為中腦多巴胺能神經(jīng)的潛能,但同時隨著培養(yǎng)時間的延長,調(diào)亡的細胞也在不斷增加[6]。有文獻報道在此種培養(yǎng)條件下細胞隨著傳代次數(shù)的增加,細胞的活力逐漸減弱,凋亡的細胞大量增加。因此,在選擇培養(yǎng)的NSCs進行移植時,不僅要考慮到細胞高表達pitx3和TH基因,同時也要盡量減少細胞的凋亡以保證移植效果[7]。

[1]Smidt MP,van Schaick HS,Lanctot C,et al.A homeodomain gene Pitx3 has highly restricted brain ex pression in mesencephalic dopaminergic neurons[J].Proc Natl Acad Sci,1997,94(24):13 305-13 310.

[2]van Den Munckhof P,Luk KC,Ste Marie L,et al.Pitx3 is required for motor activity and for survival of a subset of midbrain dopaminergic neurons[J].Development,2003,130(11):2 535-2 542.

[3]須漢鵬,楊浩,王春婷,等.中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同部位來源的神經(jīng)干細胞在體外生長特性的比較[J].解剖學報,2004,35:358-362

[4]Smidt MP,Smits SM,Peter JH,et al.Molecular mechanisms underlying midbrain dopamine neuron development and function[J].Eur J Pharmacol,2003,480(1/3):75-88.

[5]Peng C,Fan S,Li X,et al.Overexpression of pitx3 upregulates exp ression of BDNF and GDNFin SH-SY5Y cells and p rimary ventral mesencephalic cultures[J].FEBS Lett,2007,581(7):1 357-1 361.

[6]Jovorina M,Alexander S,Johannes S,et al.Spontaneous apoptosis in murinefree-floating neurosp heres[J].Exp Cell Res,2004,294:9-17.

[7]凌松.神經(jīng)干細胞及帕金森病的細胞治療[J].北京大學學報(醫(yī)學版),2002,34:378-381.