楊世紅 李美玉 劉迎春 辛守帥

（①山東省青島市畜牧獸醫(yī)研究所 266100 ②青島農業(yè)大學）

現(xiàn)代生物技術主要包括人工授精、胚胎工程技術、轉基因技術、動物克隆技術、性別控制技術、體外受精技術和分子生物技術等。80年代以來，生物技術領域的發(fā)展非常迅速，無論在基礎研究還是在開發(fā)應用方面，都取得了令世人矚目的成就。尤其在動物遺傳育種與繁殖方面，顯示出越來越強大的生命力，逐漸成為動物育種和繁殖的趨勢和主流。在家兔生產中，各種生物技術也被育種學家充分利用，對家兔品種的培育產生了重要影響?，F(xiàn)將幾種生物技術在家兔上的應用作一綜述。

1 人工授精與胚胎移植技術

人工授精就是用器械采集公畜的精液，經過品質鑒定后，再借助器械將精液輸入到發(fā)情母畜生殖道內，使其受胎。人工授精在動物育種與繁殖中的應用已有70多年的歷史，它不僅改變了家畜交配過程，更重要的是能充分發(fā)揮優(yōu)良種公畜的作用，減少公畜的飼養(yǎng)量，大大提高了公畜的配種效能，防止了生殖道傳染疾病的傳播，提高了母畜的受胎率，改良了家畜的群體。因此是家畜育種、繁殖生物技術中應用最為廣泛的一項技術。但人工授精技術在家兔育種中的應用僅有20多年的歷史[1]，盡管歷史較短，但目前一些大型集約化養(yǎng)兔場或養(yǎng)兔比較集中的地區(qū)，為提高家兔的繁殖力，大都采用人工授精的方法，且成果顯著。

胚胎移植也稱受精卵移植或簡稱卵移植，就是將1頭良種動物配種后的早期胚胎取出，移植到另1頭同種的生理狀態(tài)相同的動物體生殖器官內，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個體。1890年英國劍橋大學的Walfer Heape首次將安哥拉家兔的受精卵移植到比利時兔的輸卵管內，并成功獲得2只仔兔。此后，其它胚胎移植的動物如牛、羊等相繼問世，使得胚胎移植技術跨入了具有生產意義的畜牧業(yè)領域，為畜禽良種的繁殖推廣奠定了基礎。目前,家兔胚胎移植技術在我國已有成功的報道。

2 動物克隆技術

所謂克隆就是無性繁殖，即利用卵母細胞和另一動物體細胞轉核法，不經過受精過程而獲得新個體的方法。1997年，英國科學家Wilmut領導的研究小組通過克隆的方式獲得了世界上第一個克隆羊---多莉，多莉的誕生，標志著這一技術的重大突破?？寺⊙虻恼Q生，從理論上充分證明了已分化的動物細胞仍具有全能性，在適當?shù)臈l件下，通過基因重組可以發(fā)育成新的個體。這對于發(fā)育生物學、遺傳學理論的深入發(fā)展產生了重大影響。

繼克隆羊多莉之后，克隆動物牛、羊、鼠等在世界上多個國家先后問世。家兔因其繁殖力強、妊娠期短、很快便可獲得研究結果，因而成為核移植研究的理想模型動物。兔的胚胎細胞核移植研究起步較早，Stice 和Robl 早在1988年就已獲得世界首批6只基因型完全相同的核移植兔[2]。隨后，Collas和 Robl 改進了核移植技術，獲得了10%的移植產仔率(230枚重組胚移植后，23 只仔兔出生)[3]。常萬存等以家兔16～32細胞期胚胎卵裂球為核供體，顯微注射到去核卵母細胞中，獲得2只克隆仔兔[4]。雖然兔胚胎細胞克隆兔早已出生，但仍然存在移植妊娠率和產仔率低等問題。特別是關于受體卵母細胞胞質狀態(tài)、融合參數(shù)以及重組胚胎的培養(yǎng)方法對核移植胚胎后續(xù)發(fā)育的影響報道不一[5-7]。基于上述問題，崔奎青等對影響兔胚胎細胞核移植的相關因素進行了系統(tǒng)的研究，為提高核移植胚胎發(fā)育能力提供了依據[8]。

3 轉基因技術

轉基因技術是將外源DNA導入另一個體的基因組中，產生具有新的性狀或功能的個體。自80年代初，美國科學家首次用顯微注射法將DNA序列導入原核培育出轉基因動物以來，這項技術引起了眾多學者和生物工程公司的極大興趣。近年來，利用轉基因技術，先后培育出轉基因的鼠、羊、牛、豬、雞、兔、魚等，為動物基因工程開辟了新的途徑。

目前在轉入基因的選擇上主要有以下幾類[9]：（1）編碼蛋白基因：這類基因主要參與調節(jié)機體組織的生長發(fā)育，如生長激素基因等；（2）抗性基因；（3）經濟性狀主效基因，如豬和綿羊的高繁殖力基因和肉牛的“雙肌”基因等，這些基因與動物的生產力密切相關；（4）治療某些疾病所需的蛋白質基因。轉基因技術廣泛應用于基因治療、基因敲除、改良家畜、提高抗病力、用作生物反應器生產藥品等。

近年來，轉基因技術在家兔中取得了重大成果。潘慶杰等利用精子載體法建立了乳鐵蛋白的乳腺生物反應器轉基因家兔模型，為利用精子介導制備轉基因山羊乳腺生物反應器奠定了基礎[10]。李蘭等采用直接注射法，將脂質體或DMSO包裹的含山羊β-casein基因調控序列調控ht-pam的乳腺表達的載體注入成年公兔睪丸中，一個月后分別與正常成年母兔交配，共產生仔兔182只，經檢測，轉基因陽性率為48.2%，該方法為轉基因動物的研究提供了一種簡捷有效的新途徑[11]。中科院上海細胞研究所的研究人員構建了含乙肝表面抗原的兩種載體PMT’SA和pHBV3.0，通過顯微注射導入兔受精卵雄性原核，獲得了轉基因當代兔(F1代)。中科院發(fā)育研究所陳清軒用顯微注射法將SMT’ PGH基因導入兔胚原核，進行不同培養(yǎng)基對早期轉基因胚的影響和外源基因在早期胚中的滯留情況的研究。謝慶閣等構建了抗豬瘟Ribozyme基因表達載體，并將其導入家兔受精卵，探索對豬瘟病毒的抗性研究。王敏華報道用顯微注射法轉移抗豬瘟病毒核酶基因，獲得了轉基因兔，其抗病力明顯提高[12]。

總之，轉基因技術運用于動物遺傳育種中，不僅可以加快性狀的遺傳改良進程，提高選擇效率，還可以提高動物的抗病力。轉基因動物在醫(yī)學領域中的應用更為廣泛，如藥物的開發(fā)、器官移植等，治療人類多種疾病。因此轉基因動物育種技術的進步，不僅促進畜牧生產的發(fā)展，還可拓展家畜新的用途，為畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展提供技術力量。

4 分子遺傳標記技術

20世紀80年代以來，隨著分子生物學、分子遺傳學的迅速發(fā)展，對基因的結構和功能的研究不斷走向深入，一種新的標記方法—分子遺傳標記應運而生。分子遺傳標記是在分子水平上研究DNA的多態(tài)性，從而檢測生物個體、品種間的差異。

分子遺傳標記的方法有十多種，但從總體上分為四大類，第一類是以分子雜交為基礎的標記技術，如RFLP；第二類是以PCR為基礎的標記技術，如RAPD、SSCP、小衛(wèi)星、微衛(wèi)星等；第三類是基于 PCR與限制性酶切技術結合的DNA標記，如AFLP；第四類為單核苷酸多態(tài)性的DNA標記。

遺傳標記的分子生物技術主要應用于以下方面：（1）構建分子遺傳圖普，進行基因定位；（2）主要經濟性狀主基因或有害基因的檢測、分離和克??；（3）研究動物的起源進化、品種資源的保存、分析物種間的親緣關系、雜交親本的選擇和雜種優(yōu)勢的預測等；（4）利用DNA標記進行輔助選擇；（5）突變分析；（6）證身和父系測驗等。

目前，分子遺傳標記在豬、牛、羊、家禽等動物育種中的研究較為廣泛，但在家兔生產中研究的為數(shù)不多。楊麗萍等[13]應用RAPD對新西蘭白兔、加利福尼亞兔、布列塔尼亞配套系(ELCO)進行了遺傳分析，發(fā)現(xiàn)家兔品種內的遺傳相似度大于品種間的遺傳相似度，且ELCO的D系與新西蘭白兔、加利福尼亞兔的親緣關系較近，聚為一個類群；ELCO的A系與B系親緣關系較近，聚為一個類群。韓春梅、張嘉保等用13個微衛(wèi)星位點對吉戎兔進行了親子鑒定[14]。齊冰，何新等[15]對家兔早期胚胎發(fā)育的相關基因IFRG進行了克隆和表達，經誘導培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)在41KDa處有特異性表達蛋白，回收融合蛋白作為抗原免疫小鼠，研究發(fā)現(xiàn)，該融合蛋白具有生物免疫活性。

5 生物技術在養(yǎng)兔業(yè)中存在的問題和發(fā)展前景

目前，生物技術在家兔育種上的應用還處于初始階段，在技術和方法上尚存在一些缺限需要進一步完善，但這些先進的技術已經展示了美好的應用前景?？梢詧孕?，隨著生物技術研究的不斷深入，其在家兔生產上的應用會越來越廣泛，并將對今后養(yǎng)兔業(yè)的生產帶來巨大的效益。因而，要注重動物生物技術的研究與開發(fā)，利用我國資源的優(yōu)勢，在加強基礎研究的同時，使一批業(yè)已成熟的高新技術走向市場，走向農村，服務于優(yōu)質高效的現(xiàn)代化畜牧業(yè)。在不久的將來，動物生物技術將在現(xiàn)代畜牧業(yè)生產中大放異彩。

總之，分子生物技術的發(fā)展、現(xiàn)代生物技術與傳統(tǒng)育種手段相結合，使動物分子育種及胚胎工程育種成為可能，從而大大縮短育種的世代間隔，加速育種的進程。同時也進一步提高了動物經濟性狀的生產性能，促進了畜牧業(yè)的發(fā)展。在家兔育種及生產中，還有待于進一步充分利用現(xiàn)代生物技術，為養(yǎng)兔業(yè)提供更多更好的高產新品種。

[1]Sinkovicks G, Medgyes I and Paljak J. Some results of artifitial insemination in rabbits. Appl Rabbit Res.1983,6:43-48.

[2] Stice SL， Robl J M. Nuclear reprogramming in nuclear transplant rabbit embryos. Biology of Reproduction. 1988,39:657-664.

[3]Collas P, Robl G M. Factors effecting the efficiency of nuclear transplantation in the rabbit embryos.Biology of Reproduction.1990,43:877-884.

[4]常萬存,韓建永,馬世援等.家兔細胞核移植技術研究[J].西北農業(yè)學報,2002,11(1):17-19.

[5] 周琪,譚景和,賀桂馨等.家兔胚胎細胞核移植的研究[J].東北農業(yè)大學學報,1995,26(3):256-260.

[6]Tao T, Niemann H. Cellular characterization of blastocysts derivedfrom rabbit 4-, 8- and 16-cell embryos and isolated blastomeres cultured in vitro.Human Reproduction, 2000, 15 (4): 881-889.

[7]Gardner D K. Changes in requirements and utilization of nutrients during mammalian preimplantation embryo development and their significance in embryo culture. Theriogenology, 1998, 49 (1):83-102.

[8]崔奎青,劉慶友,謝英等.影響兔胚胎細胞核移植效率的因素[J].中國農業(yè)科學,2005,38(6):1255-1259.

[9]陳宏.現(xiàn)代生物技術與動物育種.[J]黃牛雜志,2000,26(4):1-5.

[10]潘慶杰,李 蘭, 沈 偉等.乳腺表達人乳鐵蛋白的轉基因兔制備[C]//中國畜牧獸醫(yī)學會動物繁殖學會分會第十二屆學術研討會論文集.寧波.

[11]Lan li,Wei Shen.Humman lactoferrin transgenic rabbits producted efficiently using dimethylsulfoxide-sperm-mediated gene transfer.Reproduction,Fertility and Development,2006,18:689-695.

[12]王敏華,趙啟祖.轉換抗豬瘟病毒核酶基因兔的研究[J].畜牧獸醫(yī)學報,1996,27(4):319-325.

[13]楊麗萍,張玉笙等.不同品系家兔的遺傳分析[J].中國養(yǎng)兔雜志，2000,3:15-18.

[14]韓春梅,張嘉保等.微衛(wèi)星DNA在吉戎兔親子鑒定中的應用研究[J].遺傳,2005,27(6):903-907.

[15]齊冰,何新等.兔早期胚胎發(fā)育相關新基因IFRG的克隆和表達[J].中國生物工程雜志,2006,26(6):55-58.