崔海輝 （浙江育英職業(yè)技術(shù)學(xué)院 杭州 310018）

目前使用的豬瘟活疫苗主要是豬瘟兔化弱毒疫苗和豬瘟脾淋苗[1]。豬瘟細(xì)胞活疫苗是利用動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)用豬瘟兔化弱毒株接種易感細(xì)胞培養(yǎng)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，加適宜穩(wěn)定劑，經(jīng)冷凍真空干燥制成。豬瘟細(xì)胞活疫苗和兔源豬瘟活疫苗生產(chǎn)使用的種毒均是我國(guó)自己研發(fā)的豬瘟兔化弱毒株(C株)[2]。

豬瘟細(xì)胞活疫苗在實(shí)際大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中遇到很多難題，而其中在細(xì)胞消化過(guò)程中分散液的選擇直接影響到細(xì)胞接毒后細(xì)胞毒收獲液的效價(jià)，因此細(xì)胞消化過(guò)程中一定要選擇正確的分散液[3,4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種毒 豬瘟兔化弱毒株(C株) 由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，通過(guò)兔體繼代，采集定型熱反應(yīng)兔的脾臟作毒種(簡(jiǎn)稱脾毒)。物品：5ml注射器、6號(hào)針頭、250ml或500ml錐型瓶、120目銅沙網(wǎng)漏斗、眼科剪刀鑷子、500ml大燒杯、大三角瓶（500ml或1000ml）、平皿（中號(hào)）、玻璃珠（大些的）、四層紗布漏斗、轉(zhuǎn)瓶等。凍干毒：5瓶0.8g/瓶

1.1.2 犢牛睪丸 來(lái)源浙江金華

1.1.3 配液 乳漢(歐)液、7.5%碳酸氫鈉溶液；2萬(wàn)U雙抗溶液(SP)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液)、0.25%胰酶溶液、EDTA胰酶(0.02%～0.05%)、0.4%酚紅、血清(NCS)、原代細(xì)胞生長(zhǎng)液、乳漢液+9%NCS+0.8% sp+0.5%(7.5%碳酸氫鈉)、維持液、乳漢液+2.0%NCS+ 0.8%SP+0.5%(7.5%碳酸氫鈉)、0.25%胰蛋白酶,使用時(shí)調(diào)節(jié)pH值到8.0。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞制備 操作：250ml瓶中取出牛睪丸—燒杯中洗一遍—平皿中去外皮—燒杯中洗兩遍—睪丸中間一直線剪開，用小剪刀將組織刮下—移至燒杯中洗兩遍—剪碎后洗一遍—轉(zhuǎn)至三角瓶中加入玻璃珠和適量的0.25%胰蛋白酶(無(wú)需過(guò)多胰酶)—37℃水浴消化40-50min左右—棄去胰酶，加入少量營(yíng)養(yǎng)液搖動(dòng)三角瓶(此過(guò)程未用營(yíng)養(yǎng)液洗去殘留的胰酶)，加入營(yíng)養(yǎng)液通過(guò)四層紗布漏斗分散細(xì)胞至轉(zhuǎn)瓶中(一般每付牛睪丸分散兩瓶細(xì)胞)—37℃溫室、8.5r/h培養(yǎng)，2～5d細(xì)胞生長(zhǎng)至+++與++++之間時(shí)即可接毒。觀察細(xì)胞時(shí)應(yīng)盡量減少細(xì)胞瓶?jī)?nèi)液體的流動(dòng)，24h內(nèi)不要觀察細(xì)胞。

1.2.2 一接（接毒比例0.3%） 操作：從冷庫(kù)中取出預(yù)先冷凍的乳缽，將半化開的脾毒稱取所需重量置于乳缽中研磨、搗碎，研磨后多加乳漢液，繼續(xù)研磨，讓組織中的毒得到充分釋放。將種毒吸離心瓶中，配平、2000r/min 20min離心。將脾毒上清按比例接入細(xì)胞瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 一接一傳（帶毒傳代） 將分散液、PBS溶液放在37℃恒溫水浴箱中預(yù)熱。取細(xì)胞形態(tài)良好、分布均勻且長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞瓶，將瓶身用消毒液擦拭、瓶口用消毒酒精棉擦拭后在酒精燈外焰上燒1周，打開瓶塞。將細(xì)胞瓶中原有的細(xì)胞生長(zhǎng)液倒掉，在火焰保護(hù)下向瓶?jī)?nèi)倒入適量PBS洗液，轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)胞瓶，使PBS洗液均勻漫過(guò)細(xì)胞面，洗去細(xì)胞面上存留的血清和營(yíng)養(yǎng)液，然后倒掉PBS洗液。

向細(xì)胞瓶中加入適量細(xì)胞分散液，水平方向轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)胞瓶，使細(xì)胞分散液均勻漫過(guò)細(xì)胞面，然后水平放置在桌面上，進(jìn)行下一瓶消化，同時(shí)經(jīng)常旋轉(zhuǎn)細(xì)胞瓶并密切觀察細(xì)胞面的變化，當(dāng)細(xì)胞面上出現(xiàn)肉眼可見毛玻璃樣，或出現(xiàn)針尖大小的縫隙，或因細(xì)胞分散液在瓶?jī)?nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)而出現(xiàn)細(xì)細(xì)的劃痕時(shí)，即可倒掉細(xì)胞分散液并盡量倒凈，將細(xì)胞瓶水平放在臺(tái)案上，待細(xì)胞面出現(xiàn)較大裂痕時(shí)，細(xì)胞脫離瓶壁，此時(shí)細(xì)胞在分散液的作用下仍繼續(xù)消化。經(jīng)漏鐘連接營(yíng)養(yǎng)液，向瓶?jī)?nèi)加入含9%血清的細(xì)胞生長(zhǎng)液，將細(xì)胞搖下，此時(shí)細(xì)胞停止消化。

按1:3分散率補(bǔ)足細(xì)胞生長(zhǎng)液，將細(xì)胞生長(zhǎng)液充分混勻，根據(jù)分散率均勻地分裝在無(wú)菌的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，塞好塞子，加紙帽扎緊，搖勻細(xì)胞生長(zhǎng)液，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放在轉(zhuǎn)瓶機(jī)上，轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)速為8.5r/h，置于37℃溫室中繼續(xù)培養(yǎng)。48h后鏡檢觀察。

1.2.4 一傳二接（接毒比例不低于0.35%） 操作：從冷庫(kù)中取出預(yù)先冷凍的乳缽，將半化開的脾毒稱取所需重量置于乳缽中研磨、搗碎，研磨后多加乳漢液，繼續(xù)研磨，讓組織中的毒得到充分釋放。將種毒吸離心瓶中，配平、2000r/min 20min離心。將脾毒上清按比例接入細(xì)胞瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5 二接一收 5d后收獲，將細(xì)胞病毒液收于萬(wàn)瓶中，每轉(zhuǎn)瓶留30ml母液，加維持液后繼續(xù)培養(yǎng)，4天一收，二收、三收…直至細(xì)胞脫落或到八收左右棄去。

1.2.6 取樣稀釋檢驗(yàn) 從收獲的萬(wàn)瓶中取1ml樣品，分別稀釋5萬(wàn)倍和10萬(wàn)倍，且各檢測(cè)5只常溫正常且未受過(guò)毒兔子，48h開始每6h測(cè)溫并記錄兔子體溫，直至96h。

2 結(jié)果（見表1、表2）

表1 傳代過(guò)程中細(xì)胞消化現(xiàn)象及48h后生長(zhǎng)情況記錄表

3 討論

（1）從本試驗(yàn)細(xì)胞傳代過(guò)程中如表1可以看出6種分散液消化現(xiàn)象中EDTA胰酶加0.4%酚紅消化速度快，且細(xì)胞呈單個(gè)，未見團(tuán)塊；0.25%胰酶:EDTA胰酶=3:2(一周前配,剛化)和0.25%胰酶:EDTA胰酶=4:1(一周前配,剛化)消化速度慢，未見片狀脫落現(xiàn)象，加液后都仍有團(tuán)塊。48h后觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，EDTA胰酶0.05%～0.02%和EDTA胰酶加0.4%酚紅48h長(zhǎng)滿均勻致密的單層；0.25%胰酶:EDTA胰酶=3:2(一周前配,剛化)細(xì)胞瓶上細(xì)胞非常稀，棄去；0.25%胰酶:EDTA胰酶=4:1(一周前配,剛化) 48h細(xì)胞長(zhǎng)滿不到50%，60h長(zhǎng)滿70%。

（2）通過(guò)半成品檢驗(yàn)結(jié)果表2得到用EDTA胰酶

0.05%～0.02%消化細(xì)胞的病毒收獲液5萬(wàn)倍稀釋檢測(cè)兔子3只定型熱，2只輕熱，10萬(wàn)倍稀釋檢測(cè)2只定型熱，1只輕熱，2只無(wú)反應(yīng)；用0.25%胰酶:EDTA胰酶=3:2(現(xiàn)配)化細(xì)胞的病毒收獲液5萬(wàn)倍稀釋檢測(cè)兔子2只定型熱，1只輕熱，2只無(wú)反應(yīng)，10萬(wàn)倍稀釋檢測(cè)2只輕熱，3只無(wú)反應(yīng)；用0.25%胰酶:EDTA胰酶=4:1(現(xiàn)配)消化細(xì)胞的病毒收獲液5萬(wàn)倍稀釋檢測(cè)兔子2只輕熱，3只無(wú)反應(yīng)，10萬(wàn)倍稀釋檢測(cè)全被無(wú)反應(yīng)；用0.25%胰酶:EDTA胰酶=4:1(一周前配,剛化)消化細(xì)胞的病毒收獲液5萬(wàn)倍和10萬(wàn)倍稀釋檢測(cè)兔子都無(wú)反應(yīng)；用EDTA胰酶加0.4%酚紅消化細(xì)胞的病毒收獲液5萬(wàn)倍稀釋檢測(cè)兔子4只定型熱，1只輕熱，10萬(wàn)倍稀釋檢測(cè)3只定型熱，2只輕熱。

表2 豬瘟細(xì)胞活疫苗半成品檢驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)中用EDTA胰酶加0.4%酚紅消化細(xì)胞的病毒收獲液檢測(cè)兔子起溫效果最好，可見細(xì)胞消化中分散液對(duì)細(xì)胞消化的好壞及之后生長(zhǎng)起著關(guān)鍵的作用。細(xì)胞生長(zhǎng)的好壞就直接影響到細(xì)胞瓶接毒后細(xì)胞毒收獲液的效價(jià)，因此細(xì)胞消化過(guò)程中一定要選擇正確的分散液。

[1] 張延齡,張暉.疫苗學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2004,5-8.

[2] 佚名.中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程[C].中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部,2000, 45-51.

[3] 胡顯文,肖成祖,李佐虎.細(xì)胞工程在生物制藥工業(yè)中的地位[J].生物技術(shù)通訊,2001,12(2):117-119.

[4] 鄂征.組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)[M].北京出版社，1995,76-79.

[5] R.I.費(fèi)雷什尼編.實(shí)用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液技術(shù)[M].-Animal Cell culture,a Proactical approach//潘孝珍等譯.北京:世界圖書出版公司，1996.