劉寶劍,魏彥明

(1.河北北方學(xué)院教務(wù)處,河北張家口075000;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州730070)

紅車軸草 (Trifolium pratense L.)為豆科多年生草本植物,又名紅三葉、紅花苜蓿、紅菽草、三葉草等,原產(chǎn)于小亞細(xì)亞和西南歐,在歐洲各國(guó)及俄羅斯、新西蘭等國(guó)海洋性氣侯廣泛栽培.在我國(guó)新疆、吉林、云貴高原、湖北鄂西地區(qū)都有野生,適宜在我國(guó)亞熱帶高山低溫多雨地區(qū)種植.目前,紅車軸草有許多適應(yīng)不同環(huán)境的優(yōu)良品種,各地可因地制宜選用,在甘肅岷縣等縣區(qū)已引種多年,且大面積推廣種植.紅車軸草主要含有黃酮類、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類和維生素等多種成分,黃酮類中最主要的是異黃酮,其中以鷹嘴豆芽素A(Biochanin A)、芒柄花素 (Formononetin)、染料木素 (Genistein)、大豆素(Daidzein)等4種為主.研究表明紅車軸草異黃酮具有弱的雌激素樣作用、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、改善動(dòng)脈血管的柔軟性等多種生理功用.

1 抗氧化作用

1.1 清除自由基

自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)是導(dǎo)致生物衰老和某些疾病如癌癥、心血管疾病等的重要因素.體內(nèi)過(guò)多的氧自由基 (其中·OH化學(xué)性質(zhì)最活潑)將作用于蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物大分子,造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損,進(jìn)而導(dǎo)致物質(zhì)代謝紊亂而引起疾病.清除自由基,主要依賴機(jī)體內(nèi)的酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng).已有文獻(xiàn)報(bào)道中草藥的獨(dú)特療效與其作為抗氧化劑,高效清除體內(nèi)自由基作用密切相關(guān).Wei H C等[1]研究認(rèn)為,染料木素 (Genistein)強(qiáng)烈抑制12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetate;TPA)誘導(dǎo)的髓樣白血病細(xì)胞株 HL-60細(xì)胞中 H2O2的形成,對(duì)黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生超氧陰離子也具有抑制作用.異黃酮能保護(hù)DNA不被氧化破壞,有效消除紫外線引起的8羥基脫氧鳥(niǎo)苷 (8-OHdG)形成和小牛胸腺DNA的損傷[2].異黃酮還能抑制小鼠肝組織勻漿液中脂質(zhì)的過(guò)氧化作用,能防止維生素C的氧化[3].一定濃度的紅車軸草異黃酮體外能清除超氧陰離子自由基及羥自由基作用[4].

1.2 抗氧化和對(duì)自由基損傷保護(hù)作用

Guoetal[5]研究表明,在5 nmol/L生理濃度下,染料木素和大豆黃素分別提高細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽水平約10%和30%.楊麗珍等[6]實(shí)驗(yàn)研究表明,大鼠因內(nèi)分泌改變,有關(guān)器官逐漸衰老,清除自由基能力和抗氧化能力下降,并進(jìn)而出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化作用增加,自由基清除酶類活性下降等變化.經(jīng)紅車軸草異黃酮高、低劑量及大豆異黃酮、倍美力組治療6周后,MDA濃度降低 (P＜0.01或P＜0.05),SOD活性顯著升高 (P＜0.01或P＜0.05),且紅車軸草異黃酮抗氧化作用優(yōu)于倍美力,說(shuō)明紅車軸草異黃酮通過(guò)提高SOD活性,降低MDA濃度,達(dá)到提高機(jī)體清除氧自由基能力,從而有效延緩衰老.

1.3 對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化也具有較好的抑制作用

朱宇旌等[7]用紅三葉黃酮粗提物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抗氧化效果進(jìn)行比較,添加紅三葉黃酮粗提物對(duì)豬油具有良好的抗氧化作用,其中以添加0.2%抗氧化效果最佳,與Vc的抗氧化性相當(dāng),比抗氧劑BH T效果好;另外Vc和VE等對(duì)紅三葉黃酮粗提物具有明顯的協(xié)同抗氧化作用,效果優(yōu)于單獨(dú)添加0.2%黃酮粗提物和Vc、BHT.

對(duì)紅車軸草異黃酮抗氧化活性的研究,多集中在其幾種單體的研究,而對(duì)紅車軸草總黃酮抗氧化及體外清除自由基的實(shí)驗(yàn)研究鮮見(jiàn)報(bào)道,抗氧化效果如何有待進(jìn)一步研究.

2 對(duì)免疫機(jī)能的影響

2.1 提高機(jī)體免疫力作用

異黃酮能提高動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞免疫、體液免疫.Wang W,et al.報(bào)道[8],大豆黃酮顯著提高刀豆素A(ConA)或脂多糖 (LPS)誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng).大豆黃酮還可促進(jìn)ConA誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生白介素-2(IL-2)和白介素-3(IL-3).張榮慶等[9]研究表明,每天給小鼠灌服芒柄花素 (Formononetin)或大豆黃酮 (Daidzein)明顯提高正常小鼠胸腺重量和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能,提高空斑形成細(xì)胞的溶血能力和外周血T淋巴細(xì)胞百分率;體外試驗(yàn)表明,芒柄花素或大豆黃素明顯促進(jìn)植物血凝素 (PHA)誘導(dǎo)的甲基-3H胸腺嘧啶核苷 (methyl-3H TdR)參與的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化.張榮慶等[10]試驗(yàn)還表明,妊娠后期攝入大豆黃酮 (Daidzein)可明顯提高母豬對(duì)豬瘟疫苗抗原刺激產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng),血清和初乳中豬瘟抗體和溶血素水平顯著提高,其新生仔豬血清中母源抗體水平亦顯著提高.

2.2 對(duì)淋巴細(xì)胞活化增殖和周期的影響

紅車軸草異黃酮對(duì)淋巴細(xì)胞活化增殖有一定影響.林長(zhǎng)樂(lè)等[11]利用碘化丙啶 (PI)染色流式檢測(cè)法發(fā)現(xiàn)Biochanin A也能使增殖的T淋巴細(xì)胞停滯于G0/G1期,提示干預(yù) T細(xì)胞周期分布可能與上述周期相關(guān)蛋白有關(guān).另外,實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)Biochanin A能夠下調(diào) T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD3的表達(dá)密度,且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性.表明Biochanin A對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞的活化增殖和周期具有明顯的抑制作用.

林長(zhǎng)樂(lè)等[12]還研究了鷹嘴豆芽素A抗H IV-1活性及抑制CD4+淋巴細(xì)胞早期活化作用,發(fā)現(xiàn)Biochanin A具有抗 H IV-1介導(dǎo)的細(xì)胞融合和 H IV-1復(fù)制的活性及抑制CD4+淋巴細(xì)胞早期活化作用.

3 植物激素樣作用

3.1 提高畜禽生產(chǎn)性能指標(biāo)

紅車軸草異黃酮具有弱的雌激素樣作用,能提高畜禽的生產(chǎn)性能.王國(guó)杰等[13]首次證明日糧中添喂紅三葉草異黃酮植物雌激素能促進(jìn)公仔雞睪丸和雞冠發(fā)育,使血清睪酮水平顯著提高,在連續(xù)飼喂12 d期間生長(zhǎng)速度和飼料利用效率均有所提高,提示異黃酮植物雌激素作為飼料添加劑在促進(jìn)家禽生長(zhǎng)上具有潛在的應(yīng)用前景.張榮慶等[14]研究表明異黃酮植物雌激素具有弱的雌激素活性,能抑菌,抗菌,提高機(jī)體的免疫機(jī)能,對(duì)畜禽有防病治病的作用.王偉群等[15]研究表明紅三葉草中的芒柄花素具有弱的雌激素活性,引起小公雞血清睪酮水平升高,提高瘦肉率,促進(jìn)家禽生長(zhǎng)的確切生理學(xué)機(jī)制尚待進(jìn)一步探討.

3.2 雌激素樣作用

紅車軸草異黃酮具有雌激素樣作用,增加雌性激素及雌性器官重量等指標(biāo).Burdette J E等[16]實(shí)驗(yàn)用紅車軸草提取物強(qiáng)飼缺乏雌二醇未孕雌鼠、50日齡卵巢切除鼠21 d.數(shù)據(jù)提示紅車軸草提取物能劑量依賴性增加子宮重量,且兩個(gè)高劑量組能剌激陰道細(xì)胞分化,但不能刺激乳腺細(xì)胞的增殖.在許多組織中既無(wú)抗雌激素也無(wú)雌激素的累加.這些數(shù)據(jù)表明,紅車軸草提取物 (含15%標(biāo)準(zhǔn)異黃酮)對(duì)切除卵巢的斯普拉-道來(lái) (氏)大鼠 (Sp rague-Daw ley Rat)模型實(shí)驗(yàn),具有弱的雌激素樣作用.

也有學(xué)者實(shí)驗(yàn)認(rèn)為,紅車軸草異黃酮能增加乳腺密度,對(duì)雌二醇等沒(méi)有影響.A tkinson C等[17]研究紅車軸草異黃酮在乳腺組織中是否有雌激素和抗雌激素樣作用,結(jié)果表明,常規(guī)雌激素替代療法增加乳腺密度,異黃酮補(bǔ)充物則不能增加?jì)D女乳腺密度.此外,對(duì)雌二醇、促性腺素、淋巴細(xì)胞酪氨酸激酶活性或者絕經(jīng)期癥狀沒(méi)有影響.

楊麗珍等[18]實(shí)驗(yàn),中老年雌性大鼠予以紅車軸草異黃酮胃飼后,與老年模型組相比,雌二醇 (E2)水平有極顯著升高 (P＜0.01),同時(shí)促黃體激素 (LH)水平有極顯著下降 (P＜0.01),促卵泡激素(FSH)亦有顯著下降 (P＜0.05),說(shuō)明紅車軸草異黃酮可改善老年雌性大鼠內(nèi)分泌狀況,阻止下丘腦-垂體-性腺軸機(jī)能減退.紅車軸草做為雌激素的替代品在國(guó)外被廣泛應(yīng)用于人的絕經(jīng)期相關(guān)疾病的治療,對(duì)于療效觀察與研究還有待深入.

4 抗癌細(xì)胞作用

4.1 紅車軸草提取物能通過(guò)抑制相關(guān)酶類等多種途徑而發(fā)揮抗癌作用

Roberts D W等[19]研究表明,鷹嘴豆芽素A和 (或)芒柄花素可通過(guò)直接競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞色素 P-4501(CYP1)B1結(jié)構(gòu)發(fā)揮抗癌作用或間接通過(guò)它們的代謝產(chǎn)物大豆黃素和染料木黃酮抑制CYP1 B1而發(fā)揮抗癌作用.Lam AN等[20]研究測(cè)定基于紅車軸草異黃酮的抑制鼠巨噬細(xì)胞株RAW 264.7和人類單核細(xì)胞環(huán)氧化酶活力.異黃酮在1～40μmol/L范圍內(nèi)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞和在10～100μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)人單核細(xì)胞具有顯著減少前列腺素E2的合成物和 (或)血栓烷B2(Throm boxane B2)的能力 (P＜0.001 to P＜0.05),表明對(duì)環(huán)氧化酶的抑制作用.因此,推測(cè)癌癥低發(fā)率人口與高攝入異黃酮的抑制環(huán)氧化酶活性相關(guān)的.

4.2 通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗癌作用

學(xué)者通過(guò)不同方法研究了紅車軸草提取物對(duì)癌細(xì)胞的影響,認(rèn)為能抑制癌細(xì)胞的增殖或誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡.Fung M C等[21]研究認(rèn)為鷹嘴豆芽素A不僅能劑量依賴性地抑制髓細(xì)胞性白血病WEH I-3B細(xì)胞的生長(zhǎng),而且也能誘導(dǎo)W EH I-3B細(xì)胞形態(tài)的分化.鄭杰等[22]用不同濃度的紅車軸草提取物處理BGC-823癌細(xì)胞,研究對(duì)其抑制增殖效應(yīng)及誘導(dǎo)凋亡作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紅車軸草提取物能抑制胃癌BGC-823細(xì)胞增殖,能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡.Cassady J M等[23]實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定苯并芘在倉(cāng)鼠胚胎細(xì)胞培養(yǎng)物中代謝的影響,來(lái)探討鷹嘴豆 (芽)素A抑制致癌物對(duì)細(xì)胞的作用.結(jié)果表明95%的酒精紅車軸草提取物顯著抑制苯并芘的代謝,使其與DNA結(jié)合水平降低了30%到40%.鷹嘴豆芽素A可以抑制通過(guò)碳?xì)浠衔镎T導(dǎo)的癌,能有力校正芳族碳?xì)浠锱c哺乳動(dòng)物DNA的結(jié)合以及它們的致癌活性.

尹春萍等[24]利用 TUNEL法、流式細(xì)胞術(shù)分析研究表明,紅三葉總異黃酮對(duì)MCF27細(xì)胞增殖的抑制作用隨藥物質(zhì)量濃度提高和作用時(shí)間延長(zhǎng)而更加明顯,而在低質(zhì)量濃度時(shí)卻出現(xiàn)輕微促細(xì)胞增殖現(xiàn)象,紅三葉總異黃酮能誘導(dǎo)MCF27細(xì)胞凋亡,阻滯細(xì)胞于 G2/M期,降低細(xì)胞增殖指數(shù),具有抗腫瘤作用.

4.3 抗乳腺癌作用

M izunuma H等[25]用兩種異黃酮 (鷹嘴豆芽素A、大豆黃素),通過(guò)小鼠乳房腫瘤病毒誘導(dǎo)的自發(fā)乳腺癌細(xì)胞模型來(lái)驗(yàn)證異黃酮的抗癌作用.認(rèn)為系統(tǒng)的抗癌效果可能不是通過(guò)大豆黃酮或牛尿酚,而是鷹嘴豆芽素A或染料木黃酮,來(lái)自于鷹嘴豆芽素A的染料木黃酮在腸道的微生物群的代謝過(guò)程中更可能扮演了一個(gè)抑制乳腺癌的角色,并認(rèn)為鷹嘴豆芽素A可能是染料木黃酮的前體.

4.4 防治前列腺癌

Slater M等人[26]研究,在飼喂紅車軸草異黃酮小鼠的前列腺上皮細(xì)胞顯示雌激素β受體和上皮細(xì)胞鈣粘蛋白顯著的增加,但使轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1降低.這些蛋白是被雌激素誘導(dǎo)增殖的、維持組織結(jié)構(gòu)、保持細(xì)胞表現(xiàn)型、減少瘤細(xì)胞的生成和轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化的標(biāo)記物.表明紅車軸草異黃酮對(duì)于前列腺增生能減少潛在的致瘤性轉(zhuǎn)化.Renea A Jarred等[27]研究表明,飲食中添加紅車軸草異黃酮可以通過(guò)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡抑制前列腺癌的發(fā)展,可以降低亞洲人的前列腺癌的發(fā)病率.證明通過(guò)攝入紅車軸草異黃酮 (160 mg/d)可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡.

5 防治骨質(zhì)疏松

許多學(xué)者從不同角度,用不同方法研究紅車軸草異黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松的影響,結(jié)論基本一致,認(rèn)為紅車軸草異黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松有一定的防治作用.李穎等[28]的研究表明紅車軸草異黃酮具有提高雌激素作用,可有效抑制骨吸收,降低骨轉(zhuǎn)化率,加強(qiáng)成骨細(xì)胞活性,增加骨密度,對(duì)去卵巢引起的大鼠骨質(zhì)疏松癥具有明顯的防治作用.陳琦等[29]研究結(jié)果表明,紅車軸草異黃酮通過(guò)提高血清雌激素水平,增加成骨細(xì)胞活性,降低骨高轉(zhuǎn)換率以及減少骨量丟失等多種途徑,能有效防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥.

Clifton-Bligh PB等[30]研究了紅車軸草提取物對(duì)絕經(jīng)期婦女脂質(zhì)和骨代謝的影響,結(jié)果表明,服用紅車軸草異黃酮復(fù)合提取物與顯著增加高密度脂蛋白膽固醇、血清載脂蛋白B顯著下降、6月后近端橈骨和臂骨的骨礦物質(zhì)密度顯著升高有著相關(guān)性.Wende K等[31]測(cè)定紅車軸草不同提取物剌激成骨細(xì)胞骨肉瘤HOS58細(xì)胞的活性的能力.選擇堿性磷酸酶 (ALP)作為成骨細(xì)胞活性的關(guān)鍵標(biāo)記.然而丁醇和甲醇提取物對(duì)ALP和細(xì)胞蛋白產(chǎn)物是沒(méi)有影響的,對(duì)與氯仿提取物孵育的酶活有顯著增強(qiáng).表明紅車軸草異黃酮在激活成骨細(xì)胞活性上具有一定作用.A tkinson C.等人[32]實(shí)驗(yàn)研究表明為婦女每天提供紅車軸草異黃酮—鷹嘴豆芽素A 26 m g、芒柄花素16 m g、染料木黃酮1 mg、大豆黃素0.5 mg,一年時(shí)間.能減弱骨質(zhì)的流失,可能對(duì)婦女的腰椎具有保護(hù)作用.

6 對(duì)婦女絕經(jīng)期癥狀的影響

在國(guó)外,雌激素替代療法對(duì)防治婦女絕經(jīng)期癥狀的相關(guān)研究很多,特別是從植物中諸如大豆、紅車軸草等提取黃酮類有效成分用來(lái)防治婦女更年期疾病的研究比較深入,得出的結(jié)論也不盡相同.

Coon J T等[33]利用元分析研究了紅車軸草異黃酮治療絕經(jīng)期熱潮紅效果,認(rèn)為紅車軸草異黃酮在治療絕經(jīng)期婦女熱潮紅具有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,能減少熱潮紅發(fā)生頻率.Krebs E E等人[34]根據(jù)文獻(xiàn)對(duì)植物雌激素治療絕經(jīng)期癥狀的功效和耐受性進(jìn)行評(píng)述,認(rèn)為植物雌激素如大豆食品、大豆提取物,紅車軸草提取物不能改善熱潮紅或其它絕經(jīng)期癥狀.Schult T M等人[35]研究比較兩種補(bǔ)充紅車軸草異黃酮添加物對(duì)絕經(jīng)期婦女的脂質(zhì)和骨丟失標(biāo)記物的影響.與對(duì)照組比較,對(duì)骨質(zhì)的影響沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩種異黃酮補(bǔ)充物能減少有絕經(jīng)期癥狀婦女甘油三脂的水平,但這種影響在強(qiáng)度上是很小的.

7 對(duì)絕經(jīng)婦女認(rèn)知功能的影響

Howes JB等人[36]研究紅車軸草異黃酮食品添加物對(duì)絕經(jīng)后婦女認(rèn)知功能的影響,說(shuō)明異黃酮補(bǔ)充物在絕經(jīng)期婦女認(rèn)知功能上沒(méi)有顯出主要短期的作用,但需要進(jìn)一步臨床試驗(yàn)確定是否有小的作用或者在異黃酮補(bǔ)充期間對(duì)認(rèn)知其功能的長(zhǎng)期作用.

8 對(duì)心血管系統(tǒng)的影響

A tkinson C等人[37]研究紅車軸草異黃酮對(duì)心血管風(fēng)險(xiǎn)因子的作用,測(cè)試總膽汁、LDL膽固醇、甘油三酯、HDL膽固醇、心臟收縮和舒張壓、血纖蛋白原、纖溶酶原激活物抑制劑1(PA I-1)等相關(guān)指標(biāo).認(rèn)為飲食中補(bǔ)充紅車軸草衍生物對(duì)更年期婦女心血管風(fēng)險(xiǎn)因子有一定的保護(hù)作用,證明與49～65歲更年期婦女的載脂蛋白E(Apo E)基因型相互作用有關(guān),但異黃酮單體對(duì)血脂的作用不像已被證明的那樣作用明顯.Teede H J等[38]研究表明,對(duì)血壓正常的絕經(jīng)期女人食入紅車軸草異黃酮 (Formononetin芒柄花素)可以防治動(dòng)脈血管硬化和減少總血管阻力,但對(duì)血壓沒(méi)有影響.Nestel P J等人[39]實(shí)驗(yàn)顯示攝入紅車軸草異黃酮,對(duì)改善全身組織動(dòng)脈血管的順應(yīng)性來(lái)減少冠心病冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病的風(fēng)險(xiǎn)因素,有顯著的效果.

近年來(lái),特別是在“回歸自然”綠色浪潮的推動(dòng)下,對(duì)天然產(chǎn)物有效成分的提取分析與應(yīng)用研究成為熱點(diǎn),對(duì)優(yōu)良豆科牧草-紅車軸草的相關(guān)研究也有逐年增加趨勢(shì).研究表明,紅車軸草在抗氧化、防止骨質(zhì)疏松、抗癌、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫力、治療婦女更年期綜合癥等方面具有作用.研究也發(fā)現(xiàn),在對(duì)婦女更年期綜合癥實(shí)驗(yàn)中,得出的結(jié)論也不一致,應(yīng)就此方向進(jìn)行更深入研究,以期得到更準(zhǔn)確的研究結(jié)果.同時(shí),也應(yīng)在畜禽飼料方面做一探討,發(fā)揮紅車軸草的藥用及飼用價(jià)值,為其深加工提供參考.

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