黃海榮 程 菲 曾 春 王曉紅 唐艷龍 姜 靜

(1江西省信豐縣隘高林場(chǎng),江西 信豐 331600;2江西省信豐縣林業(yè)局,江西 信豐 331600;3江西省瑞金市林業(yè)局,江西瑞金 342500;4中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所,北京 100091)

目前,已經(jīng)定名的昆蟲(chóng)有 100多萬(wàn)種,占已知?jiǎng)游锏?2/3,但是全世界仍約有 90%的昆蟲(chóng)是未知種[1]。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步以及各個(gè)學(xué)科的交叉滲透,已有 200多年歷史的昆蟲(chóng)分類學(xué)也獲得了極大的發(fā)展,特別是現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用更加速了昆蟲(chóng)分類學(xué)發(fā)展的步伐。長(zhǎng)期以來(lái),昆蟲(chóng)分類主要是以外部形態(tài)特征為依據(jù)。因?yàn)橥獠啃螒B(tài)特征較為直觀,且容易掌握,而根據(jù)昆蟲(chóng)的形態(tài)特征作為分類依據(jù)在目等分類單元中可以很好的反映物種的分類地位。但是,在小的分類單元,如屬、族、種內(nèi)則不容易確定物種的分類地位,再到種群、生態(tài)型則更難確定分類地位。20世紀(jì) 70年代以來(lái),先后出現(xiàn)了同工酶電泳、氣相色譜或氣質(zhì) -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、核酸序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(RAPD)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、分子雜交技術(shù)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)及雙鏈構(gòu)象多態(tài)性(DSCP)技術(shù)等多種現(xiàn)代生物技術(shù),極大的促進(jìn)了昆蟲(chóng)分類學(xué)的發(fā)展。

1 研究及應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1 同工酶電泳技術(shù)

20世紀(jì) 70年代以來(lái),生物化學(xué)研究手段逐漸進(jìn)入分類學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,特別是同工酶的研究已成為鑒定物種和種間親緣關(guān)系等方面的重要方法。同工酶是由不同基因位點(diǎn)或等位基因編碼的多肽鏈的單體、純聚體或雜聚體,其理化或生物性質(zhì)不同而能催化相同化學(xué)反應(yīng)的酶。同工酶能較好地反映不同昆蟲(chóng)之間的遺傳差異,具有可靠的生理特性和物種遺傳性,對(duì)物種鑒別具有重要的參考價(jià)值。由于同工酶是基因的產(chǎn)物,能直接反映基因的異同,易于觀察研究,目前已作為一種生化遺傳標(biāo)志廣泛地應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)分類學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域[2]。通過(guò)物種同工酶的研究,可以推測(cè)物種在基因水平的不同,進(jìn)而可以推測(cè)其血緣關(guān)系和進(jìn)化地位[3]。

唐樺等通過(guò)酯酶同工酶電泳發(fā)現(xiàn)光肩星天牛Anoplophora glabripennis(Motschulsky,1853)和黃斑星天牛 A.nobilis(Ganglbauer,1889)在酯酶帶上差異甚微,認(rèn)為這 2種天牛應(yīng)歸屬于同 1個(gè)種[4]。張思宇等對(duì) 15種不同色斑型異色瓢蟲(chóng)的同工酶進(jìn)行比較研究,共獲得 25個(gè)同工酶位點(diǎn),其中多態(tài)性位點(diǎn) 20個(gè),多態(tài)位點(diǎn)百分率為 80%,從而明確了其遺傳變異的主線[5]。馬春燕等分析了蝽科 3亞科、9種蝽象的酯酶同工酶,發(fā)現(xiàn)同一亞種內(nèi)不同屬種間的 EST同工酶存在明顯差異,但小于不同亞種屬種間的差異;蝽亞科和益蝽亞科的親緣關(guān)系較近,而這2個(gè)亞科和盾蝽亞科的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),這與形態(tài)學(xué)的劃分相一致[6]。

1.2 氣相色譜或氣質(zhì) -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

利用氣相色譜或氣 -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)昆蟲(chóng)表皮中碳?xì)浠衔镞M(jìn)行分析,并以此為依據(jù)對(duì)昆蟲(chóng)進(jìn)行分類鑒定是近十幾年來(lái)昆蟲(chóng)分類學(xué)發(fā)展的一個(gè)方面,主要用于近緣種及種群的研究。昆蟲(chóng)表皮中的碳?xì)浠衔锸侵复嬖谟诶ハx(chóng)上表皮中的碳數(shù)為 20～50、直鏈或支鏈、飽和或不飽和的長(zhǎng)鏈烴類,是昆蟲(chóng)表皮蠟層中主要成分[7]。據(jù)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道,昆蟲(chóng)表皮碳?xì)浠衔锏慕M分和含量在種間存在差異,即使在親緣關(guān)系很近的種之間也有明顯差異[8]。

張紅兵等應(yīng)用 GC-MS分析表明,不同種類白蟻表皮碳?xì)浠衔锝M成和含量均有差異。結(jié)果表明,我國(guó)存在異白蟻屬,它與散白蟻屬主要區(qū)別在于其表皮缺乏以下數(shù)種碳?xì)浠衔?正十七烷烴、正二十烷烴、正二十一烷烴、正二十二烷烴、正二十三烷烴、正二十四烷烴和正二十六烷烴等;卻含有一種特殊化合物異喹啉。表皮碳?xì)浠衔锓治龅慕Y(jié)果與形態(tài)分類的結(jié)果有一定差異,形態(tài)分類被鑒定為雙色散白蟻的 R.sp.1,被鑒定為小頭散白蟻的 R.sp.2,被鑒定為圓唇散白蟻的 R.sp.3,被鑒定為尖唇散白蟻的 H.sp.4,根據(jù)表皮碳?xì)浠衔锓治龅慕Y(jié)果,R.sp.1、R.sp.3和 H.sp.4可能是其他種,而R.sp.2則可能是圓唇散白蟻的亞種或其他種[9]。

1.3 核酸序列(線粒體 DNA和核糖體 DNA)分析技術(shù)

線粒體 DNA為雙鏈閉環(huán)分子。昆蟲(chóng)的線粒體DNA大小為 15.4～16.3 kb,其中含有編碼 2個(gè)核糖體 RNA(12S rRNA,16S rRNA)、22個(gè) t RNA、1個(gè)細(xì)胞色素 b、3個(gè)細(xì)胞色素氧化酶 (CO I、CO II、CO III)、6個(gè) NADH降解酶(ND 1～6)和 2個(gè) ATP酶(6和 8)的基因[10]。目前,通常用于昆蟲(chóng)分類研究的基因有以下幾種:16S rRNA、細(xì)胞色素 b、ND2、CO I、CO II等 。

潘興麗等以線粒體細(xì)胞色素 b(Cyt b)基因作為分子標(biāo)記,首次對(duì)緣蝽科 4亞科 14種昆蟲(chóng)進(jìn)行序列測(cè)定,獲得 Cyt b基因 412 bp的序列片段。以篩豆龜蝽為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),表明在亞科級(jí)關(guān)系上,姬緣蝽亞科最原始,蛛緣蝽亞科次之,巨緣蝽亞科和緣蝽亞科親緣關(guān)系較近[11]。姚銀花等通過(guò)對(duì)我國(guó)大螟 Sesam ia inferens 9個(gè)地理種群的線粒體DNA CO II基因的測(cè)序,并分析了大螟不同地理種群之間的 CO II序列的遺傳分歧及相似性,同時(shí)建立其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[12]。

核糖體 DNA是編碼核糖體 RNA的基因,是一類中度重復(fù)的 DNA序列,以串聯(lián)多拷貝形式存在于染色體 DNA中。每個(gè)重復(fù)單位由非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(NTS)、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS)和 3種 RNA(18S、5.8S、28SRNA)基因編碼區(qū)組成[13]。由于 rDNA是生物界普遍存在的遺傳結(jié)構(gòu),具有多拷貝性、編碼區(qū)保守、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)中度保守等優(yōu)點(diǎn),因而在個(gè)體及群體內(nèi)有較好的均一性,少量樣品能有效代表其來(lái)源群體的 rDNA的變異情況。因此,rDNA已成為生物系統(tǒng)進(jìn)化研究中一個(gè)非常有用的分子標(biāo)記[14]。

Flook和 Rowell測(cè)定了 29種多新翅類(Polyneoptera)昆蟲(chóng)的 18S rDNA的全序列,并結(jié)合 Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中的 8種其它昆蟲(chóng)的 18S rDNA全序列,重建了傳統(tǒng)的古翅亞部(Palaeoptera)和新翅亞部(Neop tera)昆蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育,其結(jié)果支持直翅目的單系性[15]。劉殿鋒等人測(cè)定了斑腿蝗科(Catantopidae)10亞科 20種蝗蟲(chóng)和其它蝗科 3種蝗蟲(chóng)的線粒體 16S rDNA部分序列,并從 GenBank中下載了蝗亞目(Locustodea)15個(gè)種的 16S rDNA相應(yīng)序列片段,構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),但分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果和基于形態(tài)特征的斑腿蝗科傳統(tǒng)分類結(jié)果有很大的不同[16]。

1.4 RAPD和 RFLP技術(shù)

RAPD技術(shù)是由美國(guó)杜邦公司的科學(xué)家 J.G.K.Williams和加利福尼亞生物研究所 J.Welsh兩個(gè)研究小組在 1990發(fā)展起來(lái)的以 PCR為基礎(chǔ)的一項(xiàng) DNA分子水平上的大分子多態(tài)檢測(cè)技術(shù)[17]。其原理是用隨機(jī)序列的 9-10個(gè)核苷酸的引物對(duì)基因組的 DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,再進(jìn)行電泳分離與溴化乙錠染色。RAPD技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快捷、靈敏、多態(tài)性檢出率高、所需 DNA量少等特點(diǎn),因此被迅速用于個(gè)體和品系鑒定、基因的多態(tài)分析、基因定位、構(gòu)建遺傳圖譜、標(biāo)記輔助選擇和種間遺傳分析等領(lǐng)域的研究。目前 RAPD技術(shù)已成為昆蟲(chóng)遺傳圖譜構(gòu)建中的一種普遍方法,該技術(shù)一出現(xiàn),就被用于蚊蟲(chóng)的分子系統(tǒng)學(xué)研究。

南宮自艷等采用 RAPD技術(shù),分析了 5種松毛蟲(chóng) 10個(gè)地理種群的種群內(nèi)、種群間的遺傳多樣性,檢測(cè)和描述在不同地理環(huán)境條件下的松毛蟲(chóng)種群的遺傳結(jié)構(gòu)和變異情況,為松毛蟲(chóng)的綜合防治提供有效的依據(jù)[18]。趙慧婷等采用 RAPD技術(shù)對(duì)來(lái)自中國(guó)境內(nèi) 8個(gè)省市的 28群東方蜜蜂 Apis cerana進(jìn)行了研究,探討了它們之間的親緣關(guān)系[19]。

RFLP技術(shù)(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析)是由Bostein在 1980年首先建立并發(fā)展起來(lái)的一種分子遺傳標(biāo)記技術(shù)。它是指應(yīng)用限制性內(nèi)切酶切割不同類群個(gè)體基因組 DNA或某一基因,產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的限制性片段,根據(jù)酶切圖譜,計(jì)算類群之間的遺傳距離,構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。賈正輝等應(yīng)用 PCR-RFLP技術(shù)對(duì)來(lái)自四川省 8個(gè)地方的枯死松樹(shù)樣品中的傘滑刃屬線蟲(chóng)群體進(jìn)行了分子鑒定。該研究中選用的 4種限制性內(nèi)切酶(DraⅠ 、SalⅠ 、HhaⅠ 、AluⅠ )除 SalⅠ外均可對(duì)所鑒定的 6種傘滑刃屬線蟲(chóng)產(chǎn)生特異性的酶切位點(diǎn),從而均可有效地鑒別出松材線蟲(chóng)、擬松材線蟲(chóng)和其他 4種傘滑刃屬線蟲(chóng),其結(jié)果可為今后這幾種傘滑刃屬線蟲(chóng)的分子鑒定提供一定的參照[20]。

1.5 分子雜交技術(shù)

核酸的分子雜交技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中常用的方法之一,它和克隆技術(shù)密不可分,并且在基因表達(dá)、調(diào)控以及在物種親緣關(guān)系的研究中具有重要作用。最基本的分子雜交技術(shù)包括原位雜交技術(shù)、Northern分子雜交技術(shù)和 Southern分子雜交技術(shù)。在昆蟲(chóng)學(xué)研究主要應(yīng)用核酸分子技術(shù)檢測(cè)起遺傳的多態(tài)性、DNA的同緣性和 mRNA的差異來(lái)鑒別昆蟲(chóng)的近緣種以及地理種群。分子雜交的關(guān)鍵是制備特異性強(qiáng)和靈敏度高的探針。目前應(yīng)用較多的是地高辛和生物素等非放射性標(biāo)記探針。Lorite等利用原位雜交對(duì)葉甲科 Chrysomelidae昆蟲(chóng) Chrysolina americana的微衛(wèi)星進(jìn)行了研究[21]。

1.6 SSCP和 DSCP技術(shù)

SSCP技術(shù) (單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析)及 DSCP技術(shù) (雙鏈構(gòu)象多態(tài)性分析)的基本原理相似,都是依據(jù) DNA分子在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí),其遷移率除與 DNA的長(zhǎng)短有關(guān)外,更主要的是取決于 DNA鏈所形成的構(gòu)象。SSCP技術(shù)自1989年由 Masato Orita等人建立以來(lái),就以其靈敏性廣受關(guān)注。李石柱等就使用 PCR-SSCP技術(shù)對(duì)我國(guó)多斑按蚊復(fù)合體 5個(gè)成員種進(jìn)行了分子鑒別,分析其 28S-D3擴(kuò)增產(chǎn)物,結(jié)果顯示電泳條帶具種特異性,可用于鑒別各蚊種[22]。DSCP技術(shù)在昆蟲(chóng)分類上的應(yīng)用不多,在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。

2 問(wèn)題與展望

隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,以及同工酶電泳、氣相色譜或氣質(zhì) -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、細(xì)胞遺傳學(xué)研究技術(shù)、核酸序列分析、RAPD、RFLP、分子雜交、SSCP及DSCP等分子生物學(xué)技術(shù)在昆蟲(chóng)分類研究中的應(yīng)用和有益探索,或是解決了傳統(tǒng)分類中所存在的學(xué)術(shù)疑難問(wèn)題,或是驗(yàn)證了傳統(tǒng)分類所得出的結(jié)論,已顯示出其應(yīng)有的優(yōu)勢(shì)和廣闊的發(fā)展前景。

然而生物技術(shù)在昆蟲(chóng)研究中的應(yīng)用時(shí)間畢竟不長(zhǎng),還存在不少問(wèn)題。首先是目的基因或 DNA片段的選擇,如何在龐大的昆蟲(chóng) DNA文庫(kù)中選擇最有利于昆蟲(chóng)分類、最能反映其進(jìn)化關(guān)系的基因或 DNA片段,仍存在較大難度。其次是用不同的目的基因或DNA片段對(duì)同一昆蟲(chóng)進(jìn)行研究,可能會(huì)得到不同的結(jié)果。再次是分析軟件或程序包的應(yīng)用,目前有大量的分子生物學(xué)分析軟件,不同的軟件或程序包有許多不同的假設(shè)和參數(shù),研究者采用不同的分析軟件或采用同一軟件而設(shè)置不同的參數(shù),同樣的數(shù)據(jù)可能會(huì)得到不同的結(jié)果。如何解決好這些問(wèn)題是今后昆蟲(chóng)分類科學(xué)研究工作中的重要任務(wù)。

隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展,實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn),它必然會(huì)推動(dòng)昆蟲(chóng)學(xué)在分子水平上的發(fā)展。昆蟲(chóng)分類學(xué)是昆蟲(chóng)學(xué)研究中的基礎(chǔ)領(lǐng)域,也是傳統(tǒng)領(lǐng)域,可以預(yù)見(jiàn)在不遠(yuǎn)的將來(lái),古老的昆蟲(chóng)分類研究隨著不斷創(chuàng)新的理論和技術(shù)的發(fā)展,將有新的更大的成就。

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