李代清 丁 群

表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis，SE）是最常見的凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase negative staphylococcus，CoNS）。近年來，隨著生物材料的廣泛應(yīng)用和免疫低下人群的增多，由SE造成的感染日趨嚴重，目前已成為醫(yī)院感染的主要病原菌之一。SE分泌的毒力因子及胞外酶較金黃色葡萄球菌（staphylococcus auerus，SA）少，其致病機制主要與形成生物膜有關(guān)。通過與SA做對比，現(xiàn)將耐甲氧西林表皮葡萄球菌（methicillin-resistant S.epidermidis，MRSE）的葡萄球菌染色體 mec盒（staphylococcal chromosome cassette mec,SCCmec）基因型分子流行病學特點、生物膜形成過程、相關(guān)因子及基因調(diào)控等方面的研究進展做一綜述。

1 MRSE的SCCmec基因型分子流行病學特點

MRSE發(fā)生率呈逐年升高趨勢。我國一項涉及15個城市、17家醫(yī)院的調(diào)查顯示，82.89%的臨床SE菌株對甲氧西林耐藥[1]。SE通常比SA對抗生素的耐藥性更強，但它們更多情況下僅在體內(nèi)有植入醫(yī)療裝置或免疫低下患者中引起感染[2]。甲氧西林耐藥機制主要與mecA基因有關(guān)，它是一段編碼低親和力青霉素結(jié)合蛋白2α（PBP2α）的外源性DNA，以復合體的形式存在于可移動性SCCmec上。SCCmec由mec復合體和染色體盒重組復合體（ccr）兩部分組成，根據(jù)mec和ccr同源性重組不同，可將SCCmec分為6型：其中SCCmecⅠ～Ⅲ型被歸為醫(yī)源性MRSA（healthcare-associated MRSA，HA-MRSA），攜帶多耐藥基因；而Ⅳ～Ⅵ型被歸為社區(qū)源性 MRSA（community-acquired MRSA，CA-MRSA），Ⅴ型攜帶多耐藥基因，余2型只攜帶mecA。最近，Berglund等[3]從CA-MRSA中發(fā)現(xiàn)了1個新的類型（5C1，暫被定為Ⅶ型）。而Zhang等[4]從1個典型HA-MRSA流行株C10682中發(fā)現(xiàn)了1個從未被描述過的類型（4A，暫定為Ⅷ型）。

與MRSA相比，MRSE具有更高的基因多樣性。日本一項社區(qū)帶菌者的研究顯示約40.8%的MRSE菌株含有SCCmecⅣa型組分，與世界范圍流行的CA-MRSA相似；很大一部分菌株含有非典型SCCmec結(jié)構(gòu)（與經(jīng)典類型相比），它們的基因型是多樣的，沒有發(fā)現(xiàn)一種具有單一穩(wěn)定基因型的CA-MRSE克隆株的傳播；同時，在社區(qū)源性耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌（CA-MRCNS）和CA-MRSA中存在相同的SCCmec類型也揭示了SCCmec成分在種間與種內(nèi)傳播的高度可能性[5]。

芬蘭一家醫(yī)療單位分離出的61例MRCNS中，49例（80%）為MRSE。SCCmec類型分布是多樣的：20例（33%）Ⅳ型,11例（18%）Ⅴ型,4例（6%）是Ⅰ型,3例（4%）Ⅱ型,還有23例（38%）是新類型；有2例同時攜帶MRSA和MRSE，并且這些菌株中都含有SCCmecⅤ型，由此可以推測在MRSA和MRSE之間可能有SCCmecⅤ型成分的水平遷移[6]。當前對SCCmec的具體來源還不清楚，在MSSA中并沒有mecA的等位基因，由此目前流行一種假說：SCCmec可以在葡萄球菌之間傳播，并且mecA陽性（+）的CoNS（主要是MRSE）也許為SA構(gòu)成了一個這些遺傳元件及耐藥基因的儲蓄庫[7]。

國內(nèi)醫(yī)療單位分離的菌株顯示，經(jīng)典的醫(yī)源性SCCmec類型仍占主導地位，未發(fā)現(xiàn)含SCCmecⅣ、Ⅴ型的菌株[8]。上海一家教學醫(yī)院分離出的SE臨床菌株中，多位點序列測定分析顯示80株菌株中共有16種不同的序列類型，其中ST2類型代表了被測菌株的絕大部分，共檢出4種SCCmec類型，無一例攜帶SCCmecⅠ型，所有ST2菌株均攜帶SCCmecⅢ型[9]。這些報道與國外的MRSE主要含有SCCmecⅣ和Ⅴ型且有基因多樣性不同，提示在中國的醫(yī)療單位中MRSE主要攜帶醫(yī)源性SCCmec類型。

2 SE生物膜特點

生物膜對細菌的保護作用在于：構(gòu)成抗生素的滲透屏障；減低宿主的免疫應(yīng)答、抑制吞噬細胞的防御功能，從而導致感染呈現(xiàn)慢性、持續(xù)性和反復性的特點，很難治愈。生物膜形成主要分以下階段：首先，細菌初始黏附在植入物體或宿主組織表面；隨后是細菌聚集，包括細菌增殖、細菌之間相互黏附及胞外多糖黏質(zhì)的形成等；第3步是生物膜成熟及分離階段。各階段需要不同的相關(guān)因子參與。

2.1 SE初始黏附 細菌的初始黏附是形成SE感染的第1步，具有重要作用，由于大多數(shù)生物膜在6 h內(nèi)開始形成，因此在植入術(shù)后6 h內(nèi)減少細菌附著對避免醫(yī)療裝置相關(guān)感染尤其重要[10]。生物材料植入人體后,很快被體內(nèi)多種基質(zhì)或血漿蛋白（纖維蛋白原、纖連蛋白、玻連蛋白，膠原蛋白等）覆蓋，形成一層蛋白吸附層，使進入機體的細菌附著在材料表面。細菌初始黏附通過2種作用實現(xiàn)：可逆的、非特異性物理化學力和不可逆的、特異性的配體/受體間相互作用。通常前者無特異性，隨機體吞噬作用、血流的沖擊和抗生素的應(yīng)用而被迫遷移或被殺滅。但若細菌受體遇到能與之結(jié)合的生物材料或材料表面吸附蛋白層中的配體時，則牢固地黏附在其表面，完成黏附過程中受體與配體的結(jié)合。

SE有多種黏附因子，其中識別黏附基質(zhì)分子的微生物表面組分（microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules,MSCRAMMs）在黏附定植過程中起重要作用。SE和SA都能表達許多MSCRAMMs蛋白，能結(jié)合人基質(zhì)蛋白如纖維蛋白原、纖連蛋白等。SE的MSCRAMMs主要包括Fbe、AtlE及Ssp等。MSCRAMMs可以通過共價或非共價結(jié)合連接到細菌表面。共價附著由轉(zhuǎn)肽酶催化，它能使MSCRAMMs的一個保守模序——LPXTG連接到肽聚糖上。SA能編碼28種表面蛋白，在SE中已有18種被識別。在SA的表面蛋白中，21種含有LPXTG模序，相比之下，SE只有11種左右，它們在生物膜形成中的作用尚不清楚[11]。SE和SA都有幾種非共價結(jié)合到細菌表面的表面蛋白，最常見的是AtlE，非共價結(jié)合到磷壁酸上。除了能使細胞壁更新，它也能促進細菌附著到生物材料表面且能與玻連蛋白結(jié)合，具有雙重作用[12]。

部分SE的表面蛋白因為具有特征性的絲氨酸-天冬氨酸重復跨細胞壁區(qū)域（Sdr）被歸為Sdr家族蛋白。例如與纖維蛋白原結(jié)合的SE表面蛋白被稱作纖維蛋白原結(jié)合蛋白（Fbe，也稱作SdrG），由fbe基因編碼。與已知的蛋白進行序列比較，發(fā)現(xiàn)Fbe與SA的凝集因子A（clfA）有相關(guān)性[13]。國內(nèi)研究報告，與fbe基因缺陷的突變體相比，fbe陽性的S.epidermidis HB菌株更可能引起中心靜脈導管相關(guān)感染，導致菌血癥和轉(zhuǎn)移病灶[14]，這些結(jié)果證實了在SE引起的中心靜脈導管相關(guān)感染中與Fbe相關(guān)的黏附的重要作用。SdrF通過其B區(qū)域附著到存在于傳動系統(tǒng)表面的宿主膠原蛋白上[15]，它可能在SE引起的心室輔助裝置系統(tǒng)感染的起始過程中起重要作用。

2.2 細菌增殖和聚集 在生物材料表面初始黏附后，細菌增殖、相互黏附形成多層的細菌簇，分泌胞外多糖黏質(zhì)，形成生物膜。在此階段，需要多糖胞間黏附素（PIA）、聚集相關(guān)蛋白（Aap）、生物膜相關(guān)蛋白（Bap)及血凝素等因子參與。其中PIA在葡萄球菌生物膜形成機制中所起的調(diào)節(jié)作用研究最多，它不僅能促進初始黏附，在聚集階段更具有重要作用，與其他多聚物如磷壁酸和蛋白等一起形成黏質(zhì)的主要部分。研究顯示，在SE中PIA的產(chǎn)生和去乙?；饔帽徽J為是重要的毒力因子，并對細菌的免疫逃避過程起作用[16]。

然而，一些從生物膜相關(guān)感染者分離的菌株缺乏ica基因（PIA的調(diào)控基因）,表明PIA的產(chǎn)生并不是對生物膜形成和生物膜相關(guān)感染都有普遍重要性。在非PIA依賴性的生物膜形成過程中，表面黏附蛋白如Aap、Bap等代替了PIA發(fā)揮促進細菌間黏附的作用[17]。

2.3 生物膜成熟及分離階段 經(jīng)歷了以上階段，成熟的生物膜形成復雜而有組織的結(jié)構(gòu)，它由微菌落組成，在微菌落之間圍繞著輸水通道，可以為生物膜中的細菌運送養(yǎng)料、酶、代謝產(chǎn)物和排出廢物等。根據(jù)菌種、營養(yǎng)、附著的表面和環(huán)境條件不同，細菌增殖時可以形成疏松或致密及厚薄不等的生物膜結(jié)構(gòu)。

成熟的生物膜在外部沖擊力或內(nèi)在調(diào)節(jié)機制等作用下可部分脫落，轉(zhuǎn)變成浮游狀態(tài)，遇到合適的表面可以再次黏附形成新的生物膜，此過程對細菌持續(xù)感染及播散到其他定植部位具有重要作用。分離的主要相關(guān)因素有[18]：（1）機械力，例如血流的沖刷力。（2）形成生物膜的原料產(chǎn)生停止，如胞外多糖。（3）包括能破壞基質(zhì)的酶類或表面活性劑在內(nèi)的分離因素。當破壞基質(zhì)的酶類或表面活性劑以較高的速率產(chǎn)生時將引起生物膜的分離，尤其在生物膜表面區(qū)域。實際上，可控的分離使生物膜維持一定的厚度，并控制生物膜以特定的速率播散。在葡萄球菌中，這種機制是由菌落密度傳感系統(tǒng)調(diào)控的。

3 生物膜形成的基因調(diào)控

生物膜的形成是一個極為復雜的過程，受許多因子調(diào)控，目前對其具體調(diào)控機制還不完全清楚。菌落密度傳感系統(tǒng)是細菌生物膜形成的一種重要調(diào)控機制，在葡萄球菌中最重要的是輔助基因調(diào)節(jié)（accessory gene regulator，agr）系統(tǒng)，最初在SA中被發(fā)現(xiàn)，它看起來不影響ica表達和PIA產(chǎn)生。在SA中經(jīng)典的密度感受系統(tǒng)包含當細菌密度低時對黏附因子如MSCRAMMs的上調(diào)，這種情況發(fā)生在感染的開始；當完成定植后，agr系統(tǒng)作用增強，廢止一些不需要的定植因子的表達。大量研究顯示，SA中許多MSCRAMMs的表達受agr的負性調(diào)節(jié)[19]。目前對SE生物膜基因調(diào)節(jié)方面的研究相對較少。Yarwood等[20]認為在不同生長條件下，agr對生物膜形成的調(diào)節(jié)可以從正向到負向不同，這也許反映了agr系統(tǒng)對外部環(huán)境的反應(yīng)性。另一種密度傳感系統(tǒng)，luxS系統(tǒng)最近被認為是SE生物膜形成的另一種負調(diào)節(jié)基因[21]。

PIA的生物合成是由ica基因位點調(diào)控的，它包括N-乙酰胺基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（icaA和icaD）、PIA脫乙酰酶（icaC）和一個調(diào)節(jié)基因（icaR）[18]。ica基因位點的表達受多種環(huán)境因子及調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控。在SA和SE中，一些全局調(diào)節(jié)因子能調(diào)控ica轉(zhuǎn)錄或PIA表達：包括DNA結(jié)合蛋白SarA和sigma因子SigB的上調(diào)作用，反之，luxS系統(tǒng)發(fā)揮下調(diào)作用[21-22]。具體的調(diào)節(jié)機制很復雜。研究認為SigB調(diào)節(jié)SE生物膜形成，對SA則似乎無此作用[23]。SigB通過抑制icaR轉(zhuǎn)錄進而增強icaADBC的轉(zhuǎn)錄。SarA能結(jié)合ica操縱子的啟動子通過icaR-非依賴機制正向調(diào)節(jié)ica操縱子表達[22]。SE的sarA與SA同源率84%，SA的3種sarA啟動子P1、P2、P3均存在于SE中，但這些啟動子之間的組合和間距與SA不同，提示sarA在2種細菌之間發(fā)揮的作用可能不同[24]。

目前，SE已從傳統(tǒng)意義上的條件致病菌轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N重要的病原菌，必須引起更多關(guān)注。在生物材料相關(guān)感染中，SE是最主要的致病菌。這種感染一旦發(fā)生，僅應(yīng)用抗生素往往是不夠的，多數(shù)情況下需要將植入物從體內(nèi)移除，從而導致治療失敗。另外，一些慢性疾病，如2型糖尿病，將帶來更大的免疫力低下的高危人群，這將增加SE感染，尤其是MRSE感染的發(fā)生。目前對SE的具體致病機制尚不完全清楚，需進行更多研究來發(fā)現(xiàn)新的藥物及疫苗靶點，為臨床治療帶來幫助和指導。

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