王 仙 ，袁 俐 ，李永祥 ，王遠(yuǎn)志 ，姜素華 ，吳萬貴 ，賈 衛(wèi)

（1.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832000；2.新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，新疆烏魯木齊 830002）

我國是全球結(jié)核病高發(fā)國家之一，全國第4次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，新疆結(jié)核病的發(fā)病率高于全國平均水平[1]。新疆和田地區(qū)的監(jiān)測報(bào)告[2]進(jìn)一步顯示對(duì)利福平的耐藥率不是最高，但多數(shù)耐藥菌株均有利福平耐藥現(xiàn)象，目前多數(shù)研究表明對(duì)利福平的耐藥與rpoB基因突變有關(guān)系，因此檢測對(duì)利福平的耐藥有可能作為耐多藥患者的監(jiān)測指標(biāo)。本研究對(duì)新疆部分地區(qū)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥菌株進(jìn)行因rpoB初步分析，了解突變情況，為多耐藥檢測提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌種與標(biāo)本來源

H37RV標(biāo)準(zhǔn)株由中國藥品生物制品鑒定所菌種保藏中心惠贈(zèng)，每批試驗(yàn)均以該菌株作為參比對(duì)照。從380份痰樣本中獲得98例臨床分離株，62株結(jié)核分枝桿菌初始耐藥分離株，其中單利福平耐藥株4株，多耐藥10株。標(biāo)本來自新疆伊犁、阿克蘇和石河子。根據(jù)“結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程”進(jìn)行菌種鑒定，以絕對(duì)濃度法進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)。

1.2 PCR擴(kuò)增

使用解放軍309醫(yī)院提供的rpoB擴(kuò)增試劑盒，出現(xiàn)240bp條帶即為陽性。

1.3 DNA測序

取耐利福平結(jié)核分枝桿菌的PCR產(chǎn)物送上海生物工程公司測序。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（H37RV）DNA為對(duì)照，用上述引物擴(kuò)增62株結(jié)核分枝桿菌初始耐藥分離株，其中14株RFP耐藥株，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，均擴(kuò)增出1條片段長度為240bp的產(chǎn)物。

2.2 直接測序分析

對(duì)14株利福平耐藥株的PCR產(chǎn)物直接測序，與結(jié)核分枝桿菌rpoB基因序列（Genebank L27989）經(jīng)Blast分析比較。8株是在531位密碼子突變（TCG-TTG，Ser-Leu），4株單耐藥的均在此位點(diǎn)；2株是在516位密碼子突變（GAC-GGC，Asp-Gly）；1 株是在 526 位密碼子（CAC-GAC，His-Asp）。 結(jié)果顯示11株發(fā)生了基因突變，突變率為78.6%（11/14）。

3 討論

目前研究認(rèn)為，對(duì)RFP耐藥主要是由于藥物作用于靶分子RNA聚合酶的β亞單位的編碼基因（rpoB基因）突變所致。突變引起β亞單位上關(guān)鍵氨基酸的改變，從而發(fā)生構(gòu)象改變，使藥物失去結(jié)合位點(diǎn)，這種突變與RFP耐藥有密切關(guān)系。國內(nèi)外報(bào)道表明，90%～95%的RFP耐藥菌株在rpoB基因核心區(qū)的69bp區(qū)域內(nèi)有突變[3-4]，這些突變包括點(diǎn)突變、缺失、插入等，最近又發(fā)現(xiàn)在其氨基酸終止區(qū)域的突變。迄今為止在核心區(qū)的突變尚未發(fā)現(xiàn)無意義突變。最常見的突變位點(diǎn)是 531位 TCG 變?yōu)?TTG（Ser變?yōu)?Leu），占 38.1%；526位CAC變?yōu)?TAC（His變?yōu)門yr），占21.6%；516位GAC變?yōu)镚TC（Asp變?yōu)閂al），占5.7%。因此，通過分析rpoB突變可判斷細(xì)菌對(duì)利福平的藥敏結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示，rpoB基因突變形式為點(diǎn)突變，單耐藥株表現(xiàn)為單一位點(diǎn)突變（531位），耐藥株中531位突變的占主要形式（57.1%，8/14），多耐藥株在 531、516 和 526 位均存在，未發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的聯(lián)合突變類型，其中，1例除了在526位存在突變外，在570位也存在突變位點(diǎn)。由于試劑盒擴(kuò)增rpoB基因498～574位密碼子，測序后突變位點(diǎn)可能在所擴(kuò)增片段的兩端，而測序時(shí)兩側(cè)堿基并不準(zhǔn)確，所以不能肯定是否有明確的突變存在。由于新疆結(jié)核病患病率高，有必要對(duì)耐RFP的菌株進(jìn)一步深入研究，進(jìn)而闡明對(duì)耐藥程度、基因不同區(qū)域、突變形式及頻率與多耐藥的關(guān)系。

[1]全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J].中國結(jié)核和呼吸雜志,2002,25(1):3-7.

[2]賈衛(wèi),吳衛(wèi)東,顧小明,等.新疆和田地區(qū)結(jié)核病耐藥監(jiān)測調(diào)查[J].地方病通報(bào),2008,23(1):46-52.

[3]Morris S,Bai GH,Suffys P,et al.Molecular mechanism of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis[J].JInfect Dis,1995,171(4):954-968.

[4]Telenti A,Imboden P,Marchesi F,et al.Detection of rifampin-resistant mutations in Mycobacterium tuberculosis[J].Lancet,1993,341(2):647-650.